건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리
Summary
조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.
Abstract
심혈 관 질환은 전 세계적으로 사망률의 가장 널리 퍼진 원인이며 종종 변경 된 심장 기능으로 심실 강성 증가로 이어질 수있는 고조 된 심장 섬유증에 의해 표시됩니다. 심장 심실 섬유증의 이러한 증가는 상주 섬유아세포의 활성화에 기인하지만, 이러한 세포가 기준선 또는 활성화 후 3차원(3-D) 심장 내에서 어떻게 작동하는지 잘 이해되지 는 않는다. 섬유아세포가 심장 질환과 3D 심장의 역학에 어떻게 기여하는지 조사하기 위해, 전체 마우스 심장 내에서 형광으로 표지된 심장 섬유아세포를 보여주는 세련된 CLARITY 기반 조직 클리어링 및 이미징 방법이 개발되었습니다. 조직 거주자 섬유아세포는 Rosa26-loxP-eGFP 플로레스센트 리포터 마우스를 사용하여 Tcf21-MerCreMer 노크 라인을 표현하는 심장 섬유아세포와 교차하여 유전적으로 표지되었습니다. 이 기술은 건강한 마우스와 심장 질환의 섬유성 마우스 모델에서 전체 성인 왼쪽 심실전체에 걸쳐 섬유아세포 국소화 역학을 관찰하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 하나의 부상 모델에서, 심장 섬유아세포의 독특한 패턴은 수축 방향으로 포장 된 섬유의 밴드를 따라 부상당한 마우스 심장에서 관찰되었다. 허혈성 상해 모형에서, 섬유아세포 죽음이 생겼고, 광원 국경 지역에서 재인구에 선행되었습니다. 종합적으로, 이 정제된 심장 조직 명확히 기술과 디지털화된 화상 진찰 시스템은 조직 처리로 인해 손실된 형광을 둘러싼 항체 침투 실패 또는 이전 문제점의 제한 없이 심장에 있는 심장 섬유아세포의 3-D 시각화를 허용합니다.
Introduction
심근 세포는 심혼에 있는 가장 큰 부피 분획을 포함하더라도, 심장 섬유아세포는 더 풍부하고 이 기관의 기준선 구조 및 배상 특징을 통제에 비판적으로 관련시게 관련시게 관련시다. 심장 섬유아세포는 이동성이 뛰어나고 기계적으로 반응하며, 활성화 정도에 따라 전형적으로 다양합니다. 심장 섬유아세포는 세포외 매트릭스(ECM)의 정상 수준을 유지하는 데 필요하며, 이들 세포에 의한 ECM 생산량이 너무 적거나 너무 많으며 질병1,2,3로이어질 수 있다. 질병에 그들의 중요성을 감안할 때,심장 섬유세포는 특히 과도한 섬유증4,5,6,7을제한하는 시도에서 새로운 치료 전략을 식별하는 쪽으로 조사의 점점 더 중요한 주제가되고 있습니다. 부상 시 섬유아세포는 증식및 풍부한 ECM을 분비할 수 있을 뿐만 아니라 심실을 리모델링하는 데 도움이 되는 수축 활성을 갖는 근섬유세포로 알려진 합성 세포 유형으로 활성화되고 분화합니다.
심장 섬유아세포는 2-D 배양6,8,9,10에서그들의 성질을 광범위하게 평가되었지만, 기준선이나 질병 자극으로 3-D 살아있는 심장의 특성과 역학을 훨씬 적게 이해한다. 여기서, Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer 유전 기자 시스템으로 표지된 섬유아세포의 형광을 유지하면서 성인 마우스 심장을 지우는 조직에 정제된 방법이 기재되어 있다. 심장 내에서, Tcf21은 정지 섬유아세포4의비교적 구체적인 마커이다. 타목시펜이 유도성 MerCreMer 단백질을 활성화하도록 주어진 후, 본질적으로 모든 정지 섬유아세포는 Rosa26 메뚜기에서 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 영구적으로 발현하여 생체 내에서 추적할 수 있게 합니다.
수많은 잘 확립 된 조직 청산 프로토콜이 존재하며, 그 중 일부는 심장11,12,13,14,15,16,17에적용되었습니다. 그러나, 상이한 조직 청산 프로토콜에 사용되는 시약의 대부분은 내인성 형광신호(18)를담금질하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 성인 심장은자가형광(19)을생성하는 풍부한 헴 그룹 함유 단백질로 인해 클리어하기 어렵다. 따라서, 본 프로토콜의 목표는 생체내12,13,14,16,17,20에서최적의 3D 시각화를 위해 부상당한 성인 심장에서 헤메 자동 형광의 동시억제와함께 섬유아세포 마커 형광을 보존하는 것이었다.
생체 내에서 심장 섬유아세포를 검사하려고 시도하는 이전 연구는 이러한 연구가 항체 침투 및 심장 혈관구조14,16,17,20에의해 제한되었지만 이러한 세포를 라벨에 부착 된 항체를 사용하였다. 살라몬 외는 신생아 심장에서 국소 뉴러넥스 형광의 유지보수로 조직 개폐를 보였지만, Nehrhoff 등은 골수성 세포를 표시하는 형광의 유지, 전체 심실 벽을 통한 내인성 형광의 유지가 아직 입증되지 않았으며, 이는 기준선 또는13의성인 심장 섬유아세포의 시각화를 포함하였습니다. 이 조직 청산 프로토콜은 CLARITY 방법(명확한 지질 교환 아크릴아미드-혼성 경질 영상/면역스테인링/시상 혼성화 호환 조직 하이드로겔) 및 PEGASOS(폴리에틸렌 글리콜(PEG)-관련 용매 시스템)에 기초하여 이전 프로토콜의 혼합물을 정제한다. 이 정제 된 프로토콜은 기준선에서 마우스 심장에 심장 섬유 아세포의 보다 강력한 검사와 그들이 부상의 다른 유형에 반응하는 방법의 더 강력한 검사를 허용했다. 프로토콜은 간단하고 재현 가능하며 생체 내에서 심장 섬유아세포의 행동을 특성화하는 데 도움이됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서는 생체 내에서 심장 섬유아세포의 시각화를 허용하는 조직 정리를 위한 정제된 방법을 제시합니다, 기준선과 다음 상해둘 다, 마우스 심혼에 있는 섬유아세포를 특성화하고 더 잘 이해하기 위하여. 이러한 향상된 프로토콜은 성인 또는 신생아 심장12,13,14,16,17,20에서</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 모형의 발달에 있는 그들의 원조 그리고 지도에 대한 CCHMC Confocal 화상 진찰 코어를 인정하고 싶습니다, 뿐 아니라 모든 3D 인쇄된 부분의 디자인을 위한 임상 공학에서 매트 바티. Demetria Fischesser는 건강의 국가 학회에서 교육 교부금에 의해 지원되었다, (NHLBI, T32 HL125204) 그리고 제프리 D. 몰켄틴하워드 휴즈 의료 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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