JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

ネズミ星状神経節の位置、解剖、分析

Published: December 22, 2020
doi:
10.3791/62026
, , , , ,
1Division of Cardiology,EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty,Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre,University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology,Leiden University Medical Center

Summary

心臓自律神経系、特に交感神経の神経系における病態生理学的変化は、心室性不整脈の発症および維持に寄与する。本プロトコルでは、マウスの星状神経節を特徴付け、基礎となる分子および細胞プロセスの理解を深める方法を示す。

Abstract

自律神経系は心臓電気生理学の実質的な原動力である。特にその交感神経枝の役割は、心室性不整脈(VA)の病態生理学における継続的な調査の問題である。星状神経節(SG)のニューロン   は、交感神経鎖の両側の星形構造であり   、交感神経系の重要な要素です。SGは、治療難治性VA患者における心交感神経変性による治療のための認識された標的である。SGにおける神経細胞リモデリングおよびグリア活性化はVA患者に記載されているが、不整脈の発症に先立つ可能性のある基礎となる細胞および分子プロセスは十分に理解されておらず、自律神経変調を改善するために解明されるべきである。マウスモデルは交感神経リモデリングを研究することができますが、マウスSGの同定は経験の浅い研究者にとって困難です。したがって、マウスSGの詳細な細胞および分子生物学的研究は、多くの一般的な心疾患に欠けている。ここでは、RNAレベル(遺伝子発現解析のためのRNA単離、その際のハイブリダイゼーション)、タンパク質レベル(免疫蛍光全体実装染色)、および細胞レベル(基本的形態、細胞サイズ測定)での分析のために成体マウスのSGを解剖および研究するための基本的なレパートリーについて説明します。調製技術の課題を克服するための潜在的な解決策と、自己蛍光の消光による染色の改善方法を提示します。これにより、細胞組成およびリモデリングプロセスを決定するために、確立されたマーカーを介して神経細胞とグリア細胞を可視化することができます。ここで示す方法は、VAになりやすいマウスの自律神経機能不全に関するさらなる情報を得るためにSGを特徴付けることを可能にし、心臓の自律神経系の神経およびグリア成分を調査する追加の技術によって補完することができる。

Introduction

心臓自律神経系は、交感神経、副交感神経、感覚成分の緊密に調整された平衡であり、心臓が適切な生理学的応答を有する環境変化に適応することを可能にする1,2。この平衡における障害は、例えば、交感神経活動の増加、心室性不整脈(VA)3、4の維持と同様に発症の重要な促進要因として確立されている。従って、自律的変調は、β遮断薬による交感神経活性の薬理学的減少を通じて達成され、数十年5、6年のVA患者の治療の基礎となっている。しかし、薬理学的およびカテーテルベースの介入にもかかわらず、関連する数の患者はまだ再発VA7に苦しんでいる。

心臓への交感神経入力は、主に星状神経節(SG)の神経細胞体を介して媒介され、交感神経鎖の両側の星形構造は、脳幹から心臓8、9、10に多数の胸腔内神経を介して情報を中継する。傷害後にSGから発芽した神経はVAと突然心死11、12に関連し、自律変調13、14の標的としてSGを強調する。心臓への交感神経入力の減少は、局所麻酔薬の経皮的注入を介して一時的に、またはビデオ支援胸腔鏡15、16を介してSGの部分的除去によって永久に達成することができる。心臓交感神経脱用は、有望な結果を有する治療難治性VA患者のためのオプションを提示する14,16,17.我々は、神経および神経化学的リモデリング、神経炎症およびグリア活性化が自律神経機能障害18、18を寄与または悪化させる可能性のある交感神経リモデリングの特徴であることを、これらの患者の植え付けられたSGから学んだ。それでも、これらのニューロンにおける基礎となる細胞および分子プロセスは、現在まで不明瞭なままであり、例えば、コリン作動性表現型20,21へのニューロントランス分化の役割。実験研究は、VAを治療するための新しいアプローチを提示し、例えば、光遺伝学22を介した交感神経活性の減少であるが、SGの詳細な特徴付けは、VAと手をつないで行く多くの心臓病理に依然として欠けている。これらの病理を模倣するマウスモデルは、潜在的に不整脈12、23の発症に先行する神経リモデリングを研究することを可能にする。これらは、心臓および神経系の自律神経特性解析のための更なる形態学的および機能的分析によって完了することができる。本プロトコルでは、VAの理解を深めるためにマウスSGを解剖し特徴付けできる方法の基本的なレパートリーを提供する。

Protocol

動物に関するすべての手順は、ハンブルク州動物管理使用委員会(ORG870、959)およびノルトライン・ヴェストファーレン州自然環境消費者保護庁(LANUV、07/11)によって承認され、国立衛生研究所の動物のケアと使用ガイド(2011)に準拠しました。研究は、糖尿病自発的突然変異(Lepr db;;)の男性と女性(10-24週齢)C57BL/6マウス(ストック数000664、ジャクソン研究所)およびマウスホモ接合体(db/db)またはヘテ?…

Representative Results

図 1は、SG を識別して解剖する方法を視覚化します。 左右の長角のコリ筋肉はSGとリブケージから内側に入る方向の重要なランドマークです。解剖は、筋肉と最初の肋骨の間の点線に沿って行われる。SGと交感神経鎖は白い構造として見えるようになります(図1C)。図1Dは、左の長い…

Discussion

突然の心停止が世界的に最も一般的な死因であり続けるため、VAの発症に先立つ交感神経系のニューロンおよびグリア細胞における細胞および分子プロセスの理解は高い関心を持つ。そこで、現在の原稿では、このネットワーク内のマウスエレメントであるマウスSGを同定し、RNA、タンパク質、細胞レベルでのその後の分析を行う方法の基本的なレパートリーを提供していま…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ハートウィグ・ヴィーボルトの優れた技術支援と、ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターのUKE顕微鏡イメージング施設(Umif)に、顕微鏡とサポートを提供してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)[FKZ 81Z4710141]によって資金提供されました。

Materials

96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist’s perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neurociência. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Tags

Stellate GanglionSympathetic Nervous SystemCardiac NeurocontrolCardiac ArrhythmogenesisTyrosine HydroxylaseLongus Colli MuscleParaformaldehydeSudan BlackDense BleachAntibody Permeabilization
check_url/pt/62026?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image