Localización, Disección, Y Análisis Del Ganglio Estrellado Murino
Summary
Los cambios fisiopatológicos en el sistema nervioso autónomo cardíaco, especialmente en su rama simpática, contribuyen al inicio y mantenimiento de las arritmias ventriculares. En el actual protocolo, mostramos cómo caracterizar los ganglios estrellado murine para mejorar la comprensión de los procesos moleculares y celulares subyacentes.
Abstract
El sistema nervioso autónomo es un conductor substancial de la electrofisiología cardiaca. Especialmente el papel de su rama comprensiva es una materia en curso de la investigación en la patofisiología de las arritmias ventriculares (VA). Las neuronas en los ganglios estrellados (SG) – estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática – son un componente importante de la infraestructura simpática. Los SG son una blanco reconocida para el tratamiento vía la desnervación comprensiva cardiaca en pacientes con el VA terapia-refractario. Mientras que el remodelado neuronal y la activación glial en el SG se han descrito en pacientes con el VA, los procesos celulares y moleculares subyacentes que potencialmente preceden el inicio de la arritmia se entienden solamente escaso y se deben aclarar para mejorar la modulación autonómica. Los modelos de ratón nos permiten estudiar la remodelación neuronal simpática, pero la identificación del SG murino es un desafío para el investigador inexperto. Así, los estudios biológicos celulares y moleculares profundizados del SG murine están careciendo para muchas enfermedades cardiacas comunes. Aquí, se describe un repertorio básico para la disección y el estudio de la SG en ratones adultos para análisis a nivel de ARN (aislamiento de ARN para análisis de expresión génica, hibridación in situ), nivel de proteína (inmunofluorescente de montaje entero de tinción), y el nivel celular (morfología básica, medición del tamaño celular). Presentamos soluciones potenciales para superar los desafíos en la técnica de preparación, y cómo mejorar la tinción a través del temple de la autofluorescencia. Esto permite la visualización de neuronas, así como células gliales a través de marcadores establecidos con el fin de determinar la composición celular y los procesos de remodelación. Los métodos aquí presentados permiten caracterizar el SG para obtener más información sobre la disfunción autonómica en ratones propensos al VA y pueden complementarse con técnicas adicionales que investigan los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso autónomo en el corazón.
Introduction
El sistema nervioso autónomo cardíaco es un equilibrio estrechamente regulado de componentes simpáticos, parasimpáticos y sensoriales que permite al corazón adaptarse a los cambios ambientales con la respuesta fisiológica adecuada1,2. Las alteraciones en este equilibrio, por ejemplo, un aumento de la actividad simpática, se han establecido como un factor clave para la aparición, así como el mantenimiento de las arritmias ventriculares (AV)3,4. Por lo tanto, la modulación autonómica, lograda a través de la reducción farmacológica de la actividad simpática con betabloqueantes, ha sido una piedra angular en el tratamiento de pacientes con AV durante décadas5,6. Pero a pesar de las intervenciones farmacológicas y basadas en catéteres, un número relevante de pacientes todavía sufre de VArecurrente 7.
La entrada simpática al corazón está mediada principalmente a través de cuerpos celulares neuronales en los ganglios estrellados (SG), estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática, que transmiten información a través de numerosos nervios intratorácicos desde el tronco encefálico hasta elcorazón 8,9,10. La brotación nerviosa del SG después de la lesión se asocia con el AV y la muerte súbita cardíaca11,12,destacando el SG como objetivo de la modulación autonómica13,14. Una reducción de la entrada simpática al corazón se puede lograr temporalmente a través de la inyección percutánea de anestésicos locales o permanentemente mediante la extirpación parcial de la SG a través de la toracoscopia asistida por video15,16. La denervación simpática cardíaca presenta una opción para los pacientes con AV refractaria a la terapia con resultados prometedores14,16,17. Hemos aprendido de la SG explantada de estos pacientes que la remodelación neuronal y neuroquímica, la neuroinflamación y la activación glial son sellos de remodelación simpática que podrían contribuir o agravar la disfunción autonómica18,19. Aún así, los procesos celulares y moleculares subyacentes en estas neuronas siguen siendo oscuros hasta la fecha, por ejemplo, el papel de la transdiferenciación neuronal en un fenotipo colinérgico20,21. Los estudios experimentales presentan nuevos enfoques para tratar el AV, por ejemplo, la reducción de la actividad nerviosa simpática a través de la optogenética22,pero la caracterización en profundidad de la SG todavía falta en muchas patologías cardíacas que van de la mano con el AV. Los modelos de ratón que imitan estas patologías permiten estudiar la remodelación neuronal que potencialmente precede a la aparición de arritmias12,23. Éstos se pueden completar por otros análisis morfológicos y funcionales para la caracterización autonómica del corazón y del sistema nervioso. En el presente protocolo, proporcionamos un repertorio básico de métodos que permiten diseccionar y caracterizar el SG murino para mejorar la comprensión del AV.
Protocol
Representative Results
Discussion
La comprensión de los procesos celulares y moleculares en neuronas y células gliales del sistema nervioso simpático que preceden a la aparición del AV es de alto interés, ya que la parada cardíaca súbita sigue siendo la causa más común de muerte en todo el mundo5. Por lo tanto, en el manuscrito actual, proporcionamos un repertorio básico de métodos para identificar el SG murino , un elemento murino dentro de esta red , y realizar análisis posteriores a nivel de ARN, proteína y celular…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Hartwig Wieboldt por su excelente asistencia técnica, y al Centro de Microscopía de Imágenes UKE (Umif) del Centro Médico Universitario Hamburgo-Eppendorf por proporcionar microscopios y apoyo. Esta investigación fue financiada por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
Referências
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