הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.
Abstract
זברה-פיש הפך למודל אידיאלי לחקר התפתחות השחלות של בעלי חוליות. הזקיק הוא היחידה הבסיסית של השחלה, המורכבת ביציות ותאי זקיקים שמסביב. חיוני להפריד הן תאים זקיקיים והן ביציות למטרות מחקר שונות כגון לתרבות ראשונית של תאים זקיקיים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות ביציות והפריה חוץ גופית וכו ‘. השיטה המקובלת משתמשת במלקחיים כדי להפריד בין שני התאים, שהם מייגעים, גוזלים זמן רב ויש להם נזק גבוה לבית החרמש. כאן, הקמנו שיטה פשוטה להפריד בין שני התאים באמצעות נימי זכוכית משוכים. תחת סטריאומיקרוסקופ, ביציות ותאי זקיק ניתן להפריד בקלות על ידי pipetting נימי זכוכית דק משך (הקוטר תלוי בקוטר זקיק). בהשוואה לשיטה המקובלת, שיטה חדשה זו יש יעילות גבוהה בהפרדת ביציות ותאים זקיקים ויש לו נזק נמוך ביציות. חשוב מכך, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זקיקים בשלב מוקדם כולל בשלב טרום vitellogenesis. לכן, שיטה פשוטה זו יכולה לשמש כדי להפריד תאים זקיקים וביציטים של זברה.
Introduction
זברהפיש הוא אורגניזם מודל מרכזי לחקר התפתחות בעלי חוליות ופיזיולוגיה. דג הזברה יכול לשמש מודל טוב לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות השחלות1,2,3. תכונות רבות של התפתחות השחלות נשמרות הרבה במהלך האבולוציה מדגים ליונקים1,2. בדומה בעלי חוליות אחרים, מבוגרים זברה יש שחלות אסינכרוניות, המכיל זקיקי השחלות של כל השלבים ההתפתחותיים4. הזקיק הוא מרכיב הרבייה הבסיסי של השחלה. הזקיק מורכב מן ביצית כי הוא מוקף אחד או כמה שכבות של תאים סומטיים הנקראים תאים זקיקים. התפתחות הזקיקים תלויה בתקשורת הדו-כיוונית בין ביציות לתאים זקיקיים5. חיוני להפריד תאים זקיקים וביצים מזקיקים בשחלות למטרות מחקר שונות כגון תרבות ראשונית של תאים זקיקים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות ביציות והפריה חוץ גופית.
שיטות ההפרדה המסורתיות כוללות הפרדה מכנית על ידי מלקחיים ועיכול אנזימטי6,7,8,9,10. עם זאת, ההפרדה המכנית על ידי מלקחיים היא זמן רב ומייגע. זה גם יגרום לנזק גבוה ביצית במהלך ההפרדה. למרות ששיטת עיכול האנזים פשוטה לתפעול ודורשת זמן קצר, יש לאמת את זמן הטיפול ואת ריכוז האנזימים, ושיעור השלמות וההישרדות של ביציות מבודדות אינם אידיאליים. לכן, הקמנו שיטה פשוטה להפריד בין שני התאים בשלבים התפתחותיים שונים באמצעות צינורות נימי זכוכית משוכים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים כאן שיטה חדשנית להפרדה פשוטה ומהירה של תאים זקיקים וביציטים מזקיקים בשחלות זברה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני השיטה המקובלת. העיקרי ביניהם הוא הקלות המוגברת מאוד של הפרדה עם יעילות ויעילות גבוהה, כמו רק מניפולציה אחת וחיצונית נדרשת. נקודה זו מגבירה את הישימות לחוקרים שאינם טובי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודת מחקר זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [32060170, 31601205 ו- 31560334], פרויקט חוקרים אורחים שנתמך על ידי מועצת המלגות של סין וקרן המעבדה המרכזית של המדינה לאקולוגיה של מים מתוקים וביוטכנולוגיה [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
Referências
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
