ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離
Summary
ここでは、ゼブラフィッシュの卵巣卵胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離するための簡単な方法を提示し、ゼブラフィッシュにおける卵巣の発達の調査を容易にする。
Abstract
ゼブラフィッシュは、脊椎動物の卵巣の発達を研究するのに理想的なモデルとなっています。卵胞は卵巣の基本単位であり、卵母細胞および周囲の濾胞細胞からなる。卵胞細胞の一次培養、遺伝子発現の解析、卵母細胞成熟、体外受精など様々な研究目的で、卵胞細胞と卵母細胞の両方を分離することが重要です。従来の方法は、両方のコンパートメントを分離するために鉗子を使用し、これは面倒で時間がかかり、卵母細胞に高いダメージを与えます。ここでは、引っ張られたガラスキャピラリーを用いて、両方の区画を分離する簡単な方法を確立しました。立体顕微鏡では、卵母細胞と濾胞細胞は、引っ張られた細かいガラス毛細管でピペット処理することによって容易に分離することができる(直径は卵胞の直径に依存する)。従来の方法と比較して、この新しい方法は卵母細胞と濾胞細胞の両方を分離する効率が高く、卵母細胞への損傷が少ない。さらに重要なことは、この方法は、早期の卵胞に適用することができる前の早期発生期段階で。このように、この簡単な方法は、ゼブラフィッシュの濾胞細胞および卵母細胞を分離するために使用することができる。
Introduction
ゼブラフィッシュは脊椎動物の発達と生理学の研究のための主要なモデル生物です。ゼブラフィッシュは、卵巣の発達1、2、3の分子メカニズムを研究するための良いモデルとして役立ちます。卵巣の発達の多くの特徴は、魚から哺乳類1、2への進化の間に多く保存されている。他の脊椎動物と同様に、ゼブラフィッシュの成人は非同期卵巣を有し、全発育期4の卵巣卵胞を含む。卵胞は卵巣の基本的な生殖要素である。卵胞は卵胞細胞と呼ばれる体細胞の1つまたは複数の層で囲まれている卵母細胞から成っている。卵胞の発達は卵母細胞と濾胞細胞5の間の双方向通信に依存する。卵胞細胞の一次培養、遺伝子発現解析、卵母細胞成熟、体外受精などの異なる研究目的で、卵胞細胞と卵子を卵巣卵胞から分離することが重要です。
従来の分離方法には、鉗子と酵素消化6、7、8、9、10による機械的分離が含まれる。しかし、鉗子による機械的分離は時間がかかり、面倒です。また、分離中に卵母細胞に高い損傷を引き起こす。酵素消化法は操作が簡単で短時間を要しますが、処理時間と酵素濃度を検証する必要があり、単離された卵母細胞の完全性と生存率は理想的ではありません。そこで、引っ張られたガラスの毛管管を用いて、異なる発達段階で両方の区画を分離する簡単な方法を確立しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ゼブラフィッシュ卵巣卵胞から濾胞細胞と卵母細胞を簡単かつ迅速に分離するための新しい方法を説明する。この方法は、従来法に比していくつかの利点を有する。これらの中でも、単一の外部操作のみが必要となるため、高効率と有効性で大幅に増加した分離の容易さがあります。この点は、顕微鏡解剖学が苦手な研究者に対する適用性を高める。私たちの経験によると、ガラ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は中国国立自然科学財団[32060170、31601205および31560334]、中国奨学金協議会と淡水生態学とバイオテクノロジーの国家主要研究所の基金によって支援された客員研究員プロジェクト[2020FB05]によって支援されました。
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
Referências
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
