Definition af programmet for maternal mRNA oversættelse under In vitro Modning ved hjælp af en enkelt Oocyte Reporter Assay
Summary
Denne protokol beskriver en reporter analyse for at studere reguleringen af mRNA oversættelse i enkelt oocytter under in vitro modning.
Abstract
Begivenheder i forbindelse med oocytkernemodning er blevet godt beskrevet. Men meget mindre er kendt om de molekylære veje og processer, der finder sted i cytoplasmaet som forberedelse til befrugtning og erhvervelse af totipotens. Under oocytmodning afhænger ændringer i genekspression udelukkende af oversættelse og nedbrydning af moderens messenger RNA’er (mRNA’er) snarere end af transskription. Udførelsen af oversættelsesprogrammet spiller derfor en central rolle i etableringen af oocyt udviklingskompetence til at opretholde embryoudvikling. Dette papir er en del af et fokus på at definere programmet for moderens mRNA oversættelse, der finder sted under meiotisk modning og på oocyte-til-zygote overgang. I dette metodedokument fremlægges en strategi for undersøgelse af reguleringen af oversættelsen af mål mRNA’er under in vitro oocyt modning. Her er en Ypet reporter smeltet til de 3 ‘uoversatte region (UTR) af genet af interesse og derefter mikro-injiceres i oocytter sammen med polyadenyleret mRNA kodning for mCherry at kontrollere for injiceret volumen. Ved at bruge time-lapse mikroskopi til at måle reporter akkumulering, er oversættelse satser beregnes ved forskellige overgange under oocyt meiotisk modning. Her er protokollerne for oocytisolation og injektion, time-lapse-registrering og dataanalyse blevet beskrevet ved hjælp af Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3’ UTR-reporter som et eksempel.
Introduction
En fuldt udvokset pattedyr oocyt gennemgår hurtige ændringer i forberedelsen til befrugtning og erhvervelse af totipotency. Disse ændringer er afgørende for at opretholde embryonal udvikling efter befrugtning. Selv om de begivenheder, der er forbundet med nuklear modning er relativt godt beskrevet, meget mindre er kendt om de molekylære processer og veje i oocyt cytoplasma. I de sidste faser af oocytmodningen er oocytter transskriptionsløst tavse, og genekspressionen er helt afhængig af mRNA-oversættelse og -nedbrydning1,2. Syntesen af proteiner, der er kritiske for udviklingskompetence, er derfor afhængig af et program med tidsindvis oversættelse af langlivede mRNA’er, der er blevet syntetiseret tidligere under oocytvækst1,3. Som en del af et fokus på at definere dette program af moderens mRNA oversættelse udført under meiotisk modning og på oocyte-til-zygote overgang, præsenterer dette papir en strategi for at studere aktivering og undertrykkelse af oversættelsen af målet maternelle mRNA’er i enkelt oocytter under in vitro meiotisk modning.
I denne metode er YPet åben læseramme klonet opstrøms for 3 ‘UTR af udskriften af interesse. Dernæst er mRNA’er, der kodning denne reporter mikro-injiceres i oocytter sammen med polyadenylerede mRNA’er kodning mCherry at kontrollere for injiceret volumen. Reporter akkumulering måles under in vitro oocyt meiotisk modning ved hjælp af time-lapse mikroskopi. Akkumulering af gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry registreres i individuelle oocytter, og YFP-signaler korrigeres af det plateauede niveau af den co-injicerede mCherry. Efter dataindsamlingen beregnes omregningshastighederne for forskellige tidsintervaller under in vitro oocytmet meiotisk modning ved at beregne hældningen af kurven opnået ved kurvetilpasning.
Denne tilgang giver et værktøj til eksperimentelt at bekræfte ændringer i oversættelsen af udvalgte endogene mRNA’er. Desuden gør denne metode det lettere at karakterisere de lovgivningsmæssige elementer, der styrer oversættelsen under oocytmeiotisk modning ved at manipulere cis-regulatoriske elementer i 3′ UTR af mål mRNA4,5,6. Manipulation af poly(A) halelængden giver også indsigt i adenylase/deadenylaseaktivitet i oocytter5. Mutagenesis af cis-virkende elementer eller RNA immunoprecipitation kan bruges til at studere interaktioner med cognate RNA bindende proteiner6,7. Derudover kan denne metode bruges til at identificere væsentlige komponenter i oversættelsesprogrammet, der er kritiske for oocyte udviklingskompetence ved at måle mål 3 ‘UTR oversættelse i modeller forbundet med nedsat oocyt kvalitet 8,9,10. Denne metode papir præsenterer et repræsentativt eksperiment, hvor denuded oocytter af 21-dages gamle C57/BL6 mus er blevet mikro-injiceres med en Ypet reporter smeltet til 3 ‘UTR af IL-7. Opsætningen og protokollen for oocytinjektion, time-lapse-registrering og dataanalyse er blevet beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede metode beskriver en strategi for undersøgelse af aktivering og undertrykkelse af oversættelse af mål mRNA ved forskellige overgange under in vitro oocyt meiotisk modning. IL-7, en cytokin frigivet af oocyt, der kan være involveret i oocyt-cumulus cellekommunikation8,13, blev valgt med det formål at beskrive denne metode. IL-7 er kendt for at blive mere og mere oversat under oocyt modning8 og giver mulighed f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM097165, GM116926 og Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 til Marco Conti. Enrico M. Daldello blev støttet af et stipendium fra Lalor Foundation og Natasja G. J. Costermans blev støttet af et Rubicon-stipendium fra Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Referências
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
