Definiera programmet för moderns mRNA-översättning under in vitro-mognad med hjälp av en enda Oocyte Reporter-analys
Summary
Detta protokoll beskriver en reporter analys att studera regleringen av mRNA översättning i enstaka äggceller under in vitro mognad.
Abstract
Händelser i samband med oocyte nukleära mognad har beskrivits väl. Men mycket mindre är känt om de molekylära vägar och processer som äger rum i cytoplasman som förberedelse för befruktning och förvärv av totipotens. Under oocyte mognad beror förändringar i genuttryck uteslutande på översättning och nedbrytning av moderns budbärar-RNAs (mRNAs) snarare än på transkription. Genomförandet av översättningsprogrammet spelar därför en nyckelroll för att etablera oocyteutvecklingskompetens för att upprätthålla embryoutvecklingen. Detta dokument är en del av ett fokus på att definiera programmet för moderns mRNA översättning som äger rum under meiotisk mognad och vid oocyte-till-zygote övergången. I detta metoddokument presenteras en strategi för att studera regleringen av översättning av mål mRNAs under in vitro oocyte mognad. Här smälts en Ypet-reporter till 3′ oöversatta regionen (UTR) av genen av intresse och sedan mikroin injiceras i oocyter tillsammans med polyadenylerad mRNA kodning för mCherry att kontrollera för injicerad volym. Genom att använda tidsfördröjningsmikroskopi för att mäta reporterackumulering beräknas översättningshastigheterna vid olika övergångar under oocyte meiotisk mognad. Här har protokollen för oocytisolering och injektion, timelapse-inspelning och dataanalys beskrivits, med hjälp av Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR-reportern som exempel.
Introduction
En fullvuxen däggdjur oocyte genomgår snabba förändringar i förberedelse för befruktning och förvärv av totipotency. Dessa förändringar är nödvändiga för att upprätthålla embryonal utveckling efter befruktning. Även om händelserna i samband med nukleära mognad är relativt väl beskrivna, är mycket mindre känt om de molekylära processerna och vägarna i oocyt cytoplasma. Under de sista stadierna av oocyte mognad, oocyter är transkriptionellt tyst, och genuttryck är helt beroende av mRNA översättning och nedbrytning1,2. Syntesen av proteiner som är kritiska för utvecklingskompetens förlitar sig därför på ett program för tidsbeställning av långlivade mRNAs som har syntetiserats tidigare under oocyttillväxt1,3. Som en del av ett fokus på att definiera detta program av moderns mRNA översättning utförs under meiotic mognad och vid oocyte-till-zygote övergången, presenterar detta dokument en strategi för att studera aktivering och förtryck av översättning av mål moderns mRNAs i enstaka äggceller under in vitro meiotic mognad.
I den här metoden klonas YPet:s öppna läsram uppströms 3′ UTR av den avskrift av intresse. Därefter injiceras mRNAs kodning denna reporter i oocyter tillsammans med polyadenylerade mRNAs kodning mCherry för att kontrollera för injicerad volym. Reporter ackumulering mäts under in vitro oocyte meiotic mognad med tid-förfall mikroskopi. Ackumulering av gult fluorescerande protein (YFP) och mCherry registreras i enskilda oocyter, och YFP-signaler korrigeras av den platåerade nivån hos den samin injicerade mCherry. Efter datainsamling beräknas omräkningshastigheterna för olika tidsintervall under in vitro-oocyte meiotisk mognad genom beräkning av lutningen på kurvan som erhålls genom kurvpassning.
Den här metoden ger ett verktyg för att experimentellt bekräfta ändringar i översättningen av utvalda endogena mRNAs. Dessutom underlättar denna metod karakteriseringen av regleringselement som styr översättning under oocyte meiotisk mognad genom att manipulera cis-reglerande element i 3′ UTR av mål mRNAs4,5,6. Manipulering av poly(A) svanslängd ger också insikt i adenylas/ deadenylase aktivitet i oocyter5. Mutagenes av cis-verkande element eller RNA immunprecipitation kan användas för att studera interaktioner med cognate RNA bindandeproteiner 6,7. Dessutom kan denna metod användas för att identifiera väsentliga komponenter i översättningsprogrammet som är avgörande för oocyteutvecklingskompetens genom att mäta mål 3′ UTR-översättning i modeller associerade med minskad oocytkvalitet 8,9,10. Detta metodpapper presenterar ett representativt experiment där denuded oocyter av 21-dagars gamla C57/BL6 möss har mikro-injicerats med en Ypet reporter smält till 3′ UTR il-7. Inställning och protokoll för oocyte injektion, time-lapse inspelning och data analys har beskrivits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterade metoden beskriver en strategi för att studera aktivering och förtryck av översättning av mål mRNA vid olika övergångar under in vitro oocyte meiotic mognad. IL-7, en cytokin som frigörs av äggcellen som kan vara involverad i oocyt-cumulus cell kommunikation8,13, valdes för att beskriva denna metod. IL-7 är känt för att alltmer översättas under oocyte mognad8 och möjliggör god visualisering av tran…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM097165, GM116926 och Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 till Marco Conti. Enrico M. Daldello stöddes av ett stipendium från Lalor Foundation och Natasja G. J. Costermans fick stöd av ett Rubicon-stipendium från Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Referências
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
