Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest
Summary
Dit protocol beschrijft een reportertest om de regulatie van mRNA-vertaling in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro rijping te bestuderen.
Abstract
Gebeurtenissen in verband met nucleaire rijping van oöcyten zijn goed beschreven. Er is echter veel minder bekend over de moleculaire paden en processen die plaatsvinden in het cytoplasma ter voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Tijdens de rijping van de oöcyt zijn veranderingen in genexpressie uitsluitend afhankelijk van de vertaling en afbraak van maternal messenger RNAs (mRNAs) in plaats van van transcriptie. De uitvoering van het vertaalprogramma speelt daarom een sleutelrol bij het vaststellen van oöcytontwikkelingscompetentie om de embryoontwikkeling te ondersteunen. Dit artikel maakt deel uit van een focus op het definiëren van het programma van maternale mRNA-vertaling dat plaatsvindt tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang. In dit methodedocument wordt een strategie gepresenteerd om de regulering van de vertaling van doelmaBO’s tijdens de rijping van in vitro oöcyt te bestuderen. Hier wordt een Ypet-verslaggever gefuseerd met het 3′ onvertaalde gebied (UTR) van het interessegen en vervolgens micro-geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNA-codering voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Door time-lapse microscopie te gebruiken om de accumulatie van verslaggevers te meten, worden vertaalsnelheden berekend bij verschillende overgangen tijdens de oöcytmeiotische rijping. Hier zijn de protocollen voor oöcytisolatie en injectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse beschreven, met behulp van de UTR-verslaggever Ypet/interleukine-7 (IL-7)-3′ als voorbeeld.
Introduction
Een volgroeide zoogdierocyt ondergaat snelle veranderingen in de voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Deze veranderingen zijn essentieel om de embryonale ontwikkeling na de bevruchting te ondersteunen. Hoewel de gebeurtenissen die gepaard gaan met nucleaire rijping relatief goed worden beschreven, is er veel minder bekend over de moleculaire processen en paden in het oöcytcytoctoplasma. Tijdens de laatste stadia van de rijping van de oöcyt zijn oöcytcellen transcriptief stil en is de genexpressie volledig afhankelijk van mRNA-vertaling en afbraak1,2. De synthese van eiwitten die van cruciaal belang zijn voor ontwikkelingscompetentie is daarom gebaseerd op een programma van getijde vertaling van langlevende mRNAs die eerder zijn gesynthetiseerd tijdens oöcytgroei1,3. Als onderdeel van een focus op het definiëren van dit programma van maternale mRNA-vertaling uitgevoerd tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang, presenteert dit artikel een strategie om de activering en onderdrukking van de vertaling van doel maternale mRNAs in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro meiotische rijping te bestuderen.
Bij deze methode wordt het YPet open leesframe gekloond vóór de 3′ UTR van het transcript van belang. Vervolgens worden mRNAs die coderen voor deze reporter micro geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNAs die coderen voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Reporter accumulatie wordt gemeten tijdens in vitro oöcyt meiotische rijping met behulp van time-lapse microscopie. De accumulatie van geel fluorescerend eiwit (YFP) en mCherry wordt geregistreerd in individuele oöcyten en YFP-signalen worden gecorrigeerd door het plateauniveau van de co-geïnjecteerde mCherry. Na het verkrijgen van gegevens worden de omrekeningssnelheden berekend voor verschillende tijdsintervallen tijdens de in vitro oöcytmeiotische rijping door de helling van de curve te berekenen die wordt verkregen door curve-fitting.
Deze aanpak biedt een hulpmiddel om veranderingen in de vertaling van geselecteerde endogene mRNAs experimenteel te bevestigen. Bovendien vergemakkelijkt deze methode de karakterisering van regulerende elementen die de vertaling tijdens de oöcytmeiotische rijping regelen door cis-regulerende elementen van de 3′ UTR van doelmaRNAs4,5,6temanipuleren . Manipulatie van de poly(A) staartlengte geeft ook inzicht in adenylase/deadenylase activiteit in oöcyten5. Mutagenese van cis-acterende elementen of RNA-immunoprecipitatie kan worden gebruikt om interacties met cognate RNA-bindende eiwitten6,7te bestuderen . Bovendien kan deze methode worden gebruikt om essentiële componenten van het vertaalprogramma te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkelingscompetentie van oöcyt door doel 3′ UTR-vertaling te meten in modellen die verband houden met verminderde oöcytkwaliteit 8,9,10. Dit methodedocument presenteert een representatief experiment waarbij gedenudeerde oöcyten van 21 dagen oude C57/BL6 muizen micro-geïnjecteerd zijn met een Ypet reporter gefuseerd met de 3′ UTR van IL-7. De installatie en het protocol voor oöcytinjectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse zijn beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methode beschrijft een strategie om activering en onderdrukking van de vertaling van doelmiER bij verschillende overgangen tijdens in vitro oöcytmeiotische rijping te bestuderen. IL-7, een cytokine vrijgegeven door de oöcyt die betrokken kan zijn bij oöcyt-cumulus cel communicatie8,13, werd gekozen voor het beschrijven van deze methode. HET is bekend dat IL-7 steeds vaker wordt vertaald tijdens oöcytrijping8 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM097165, GM116926 en Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 aan Marco Conti. Enrico M. Daldello werd ondersteund door een fellowship van de Lalor Foundation en Natasja G. J. Costermans werd ondersteund door een Rubicon fellowship van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO).
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Referências
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
- Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
