Este protocolo descreve um método de rotina para o uso de microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM), uma poderosa técnica de imagem 3D. A aplicação bem sucedida do SBF-SEM depende de técnicas adequadas de fixação e coloração de tecidos, bem como cuidadosa consideração das configurações de imagem. Este protocolo contém considerações práticas para a totalidade deste processo.
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Artigo de método
Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) permite a coleta de centenas a milhares de imagens ultraestruturais registradas em série, oferecendo uma visão tridimensional sem precedentes da microanato tecidual. Embora a SBF-SEM tenha visto um aumento exponencial no uso nos últimos anos, aspectos técnicos como a preparação adequada do tecido e parâmetros de imagem são primordiais para o sucesso dessa modalidade de imagem. Este sistema de imagem se beneficia da natureza automatizada do dispositivo, permitindo que se deixe o microscópio desacompanhado durante o processo de imagem, com a coleta automatizada de centenas de imagens possíveis em um único dia. No entanto, sem a preparação adequada da ultraestrutura celular de preparação tecidual pode ser alterada de tal forma que conclusões incorretas ou enganosas possam ser tiradas. Além disso, as imagens são geradas pela varredura da face do bloco de uma amostra biológica incorporada à resina e isso muitas vezes apresenta desafios e considerações que devem ser abordadas. O acúmulo de elétrons dentro do bloco durante a imagem, conhecido como "carregamento de tecido", pode levar a uma perda de contraste e uma incapacidade de apreciar a estrutura celular. Além disso, enquanto o aumento da intensidade/tensão do feixe de elétrons ou a diminuição da velocidade de varredura do feixe pode aumentar a resolução da imagem, isso também pode ter o infeliz efeito colateral de danificar o bloco de resina e distorcer imagens subsequentes na série de imagens. Aqui apresentamos um protocolo de rotina para a preparação de amostras de tecido biológico que preserva a ultraestrutura celular e diminui o carregamento de tecidos. Também fornecemos considerações de imagem para a rápida aquisição de imagens seriais de alta qualidade com danos mínimos ao bloco tecidual.
Introdução
A microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais (SBF-SEM) foi descrita pela primeira vez por Leighton em 1981, onde ele criou um microscópio eletrônico de varredura aumentado com um microtome embutido que poderia cortar e imagem fina seções de tecido embutido na resina. Infelizmente, limitações técnicas restringiram seu uso a amostras condutoras, pois amostras não condutoras como tecido biológico acumularam níveis inaceitáveis de carregamento (acúmulo de elétrons dentro da amostra de tecido)1. Embora o revestimento da face do bloco entre os cortes com o carregamento de tecido reduzido de carbono evaporado, este tempo de aquisição....
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Protocolo
Todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes descritas na Declaração de Visão e Oftalmologia da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Visão e Pesquisa Oftalmológica e nas diretrizes de manejo animal da Faculdade de Optometria da Universidade de Houston. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelas instituições em que foram tratados: procedimentos de rato, rato, coelho, cobaia e primatas não humanos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Houston, procedimentos de zebrafish foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de DePauw, e procedimentos ....
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Resultados
Córnea-de-rato
Este protocolo foi aplicado extensivamente à córnea do rato. Utilizando imagens SBF-SEM, uma rede de pacotes de microfibril sem elastina (EFMBs) mostrou-se presente dentro da córnea do rato adulto. Acreditava-se anteriormente que essa rede só estava presente durante o desenvolvimento pós-natal embrionário e precoce. A SBF-SEM revelou uma extensa rede EFMB em toda a córnea, com fibras individuais encontradas com 100-200 nm de diâmetro quando medidas em seção transversal. Verificou-se tam.......
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Discussão
O objetivo deste artigo de métodos é destacar a metodologia de preparação e imagem de tecidos que permitiu ao nosso laboratório capturar de forma confiável imagens de microscopia eletrônica serial de alta resolução, e apontar passos críticos que levam a esse resultado, bem como potenciais armadilhas que podem ocorrer ao realizar imagens SBF-SEM. O sucesso com este protocolo requer fixação adequada do tecido, impregnação de metais pesados na amostra, modificações da resina de incorporação para reduzir o carregamento, bem .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown e Margaret Gondo por sua excelente assistência técnica. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 EY-018239 e P30 EY007551 (National Eye Institute), em parte pela Lion's Foundation for Sight, e em parte pelo NIH 1R15 HD084262-01 (Instituto Nacional de Saúde Infantil & Desenvolvimento Humano).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1/16 x 3/8 Rebites de Alumínio | Rebite Industrial & Fixador Co. | 6N37RFLAP/1100 | Usado como pinos de amostra. |
| Chave de fenda de cabeça chata de 2,5 mm | Wiha Quality Tools | 27225 | |
| Acetona | Microscopia Eletrônica Ciências | RT 10000 | Usado para diluir tinta prateada. |
| Ácido aspártico | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| Cloreto de cálcio | FisherScientific | C79-500 | |
| Tinta Prata Condutiva | Ted Pella | 16062 | |
| Denton Desk-II Dispositivo de pulverização a vácuo equipado com alvo de folha de ouro padrão | Denton Vacuum | N/A | Este é o dispositivo de pulverização catódica de ouro usado pelos autores, alternativas são aceitáveis. |
| Navalhas de dois gumes | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | Ciências de Microscopia Eletrônica | 14120 | |
| Gatan 3View2 montado em um Tescan Mira3 Emissão de campo | SEM Gatan & Tescan | N/A | Este é o dispositivo SBF-SEM usado pelos autores, alternativas são aceitáveis. |
| Frascos de Vidro, 0.5 DRAM (1.8 ml) | Electroscopy Sciences | 72630-05 | |
| Gluteraldeído | Microscopia Eletrônica Sciences | 16320 | |
| Gorilla Super Glue - Impact Tough | NA | NA | Referido como cola de cianoacrilato no texto. |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | Referido como negro de fumo no texto. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| Nitrato de Chumbo | Fisher Scientific | L62-100 | |
| Pelco | BioWave Pro | Este é o micro-ondas usado pelos autores, alternativas são aceitáveis. | |
| Tetróxido de Ósmio | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| Ferrocianeto de Potássio | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Molde de Incorporação de Silicone | Ted Pella | 10504 | |
| Cacodilato de Sódio Trihidratado | Microscopia Eletrônica Sciences | 12300 | |
| Pipeta de Transferência Samco | ThermoFisher Scientific | 202 | Usado para fazer pino de amostra tubos de armazenamento. |
| Arquivos de agulha de padrão suíço | Microscopia eletrônica Sciences | 62115 | |
| Tiocarbohidrazida | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Acetato de uranila | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Reconstruction Software | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Usado para criar as reconstruções encontradas nas figuras 5-7 e 9. |
| Fiji (Fiji é apenas ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2 pode ser adicionado a Fiji para auxiliar na segmentação manual. |
| Navegador de imagens de microscopia (MIB) | Universidade de Helsinque, Instituto de Biotecnologia | N / A | |
| Laboratório de Sistemas Neurais | de Software de Reconstrução | N / A | |
| SuRVoS Workbench | Fonte de luz de diamante e Universidade de Nottingham | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Permite a reconstrução em realidade virtual e métodos de reconstrução baseados em histogramas. |
Referências
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscop....
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Reimpressões e permissões
