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Biologia

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Routinemethode für die Verwendung der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM), einer leistungsstarken 3D-Bildgebungstechnik. Die erfolgreiche Anwendung von SBF-SEM hängt von der richtigen Fixierung und Gewebefärbung sowie der sorgfältigen Berücksichtigung der Bildgebungseinstellungen ab. Dieses Protokoll enthält praktische Überlegungen für den gesamten Prozess.

Abstract

Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) ermöglicht die Erfassung von Hunderten bis Tausenden von seriell registrierten ultrastrukturellen Bildern und bietet eine beispiellose dreidimensionale Ansicht der Gewebemikroanatomie. Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung. Dieses Bildgebungssystem profitiert von der automatisierten Natur des Geräts, so dass man das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt lassen kann, wobei die automatisierte Erfassung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist. Ohne entsprechende Gewebevorbereitung kann die zelluläre Ultrastruktur jedoch so verändert werden, dass falsche oder irreführende Rückschlüsse gezogen werden können. Darüber hinaus werden Bilder durch Scannen der Blockfläche einer in Harz eingebetteten biologischen Probe erzeugt, was oft Herausforderungen und Überlegungen mit sich bringt, die angegangen werden müssen. Die Ansammlung von Elektronen innerhalb des Blocks während der Bildgebung, bekannt als “Gewebeladung”, kann zu einem Kontrastverlust und einer Unfähigkeit führen, die Zellstruktur zu schätzen. Während eine Erhöhung der Elektronenstrahlintensität / -spannung oder die Verringerung der Strahlabtastgeschwindigkeit die Bildauflösung erhöhen kann, kann dies auch den unglücklichen Nebeneffekt haben, den Harzblock zu beschädigen und nachfolgende Bilder in der Bildgebungsserie zu verzerren. Hier stellen wir ein Routineprotokoll für die Vorbereitung biologischer Gewebeproben vor, das die zelluläre Ultrastruktur bewahrt und die Gewebeladung verringert. Wir bieten auch bildgebende Überlegungen für die schnelle Aufnahme von qualitativ hochwertigen Serienbildern mit minimaler Schädigung des Gewebeblocks.

Introduction

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) wurde erstmals 1981 von Leighton beschrieben, wo er ein Rasterelektronenmikroskop mit einem eingebauten Mikrotom entwickelte, das dünne Gewebeschnitte schneiden und abbilden konnte, die in Harz eingebettet waren. Leider beschränkten technische Einschränkungen die Verwendung auf leitfähige Proben, da nicht leitende Proben wie biologisches Gewebe inakzeptable Ladungsniveaus (Elektronenaufbau innerhalb der Gewebeprobe) ansammelten1. Während die Blockfläche zwischen den Schnitten mit verdampfter kohlenstoffreduzierter Gewebeladung beschichtet wurde, blieb diese stark erhöhte Bildgebungsaufnahmezeit und Bildspeicherung ein Problem, da die Computertechnologie zu dieser Zeit nicht ausreichte, um die vom Gerät erzeugten großen Dateigrößen zu verwalten. Diese Methodik wurde 2004 von Denk und Horstmann mit einem SBF-SEM mit variabler Druckkammer2überarbeitet. Dies ermöglichte die Einführung von Wasserdampf in die Bildgebungskammer, was die Aufladung innerhalb der Probe reduziert und die Bildgebung von nichtleitenden Proben möglich macht, wenn auch mit einem Verlust der Bildauflösung. Weitere Verbesserungen in der Gewebevorbereitung und bildgebenden Verfahren ermöglichen nun die Bildgebung mit Hochvakuum, und die SBF-REM-Bildgebung ist nicht mehr auf Wasserdampf angewiesen, um die Ladung3,4,5, 6,7,8,9abzuleiten . Während SBF-SEM in den letzten Jahren einen exponentiellen Anstieg des Einsatzes verzeichnet hat, sind technische Aspekte wie die richtige Gewebevorbereitung und Bildgebungsparameter für den Erfolg dieser Bildgebungsmodalität von größter Bedeutung.

SBF-SEM ermöglicht die automatisierte Erfassung von Tausenden von seriell registrierten Elektronenmikroskopiebildern mit einer planaren Auflösung von nur 3-5 nm10,11. Gewebe, das mit Schwermetallen imprägniert und in Harz eingebettet ist, wird in ein Rasterelektronenmikroskop (REM) gelegt, das ein ultramikrotom mit einem Diamantmesser enthält. Eine ebene Oberfläche wird mit dem Diamantmesser geschnitten, das Messer wird zurückgezogen und die Oberfläche des Blocks wird in einem Rastermuster mit einem Elektronenstrahl gescannt, um ein Bild der Gewebe-Ultrastruktur zu erstellen. Der Block wird dann um eine bestimmte Menge (z. B. 100 nm) in der z-Achse angehoben, die als “z-Schritt” bezeichnet wird, und eine neue Oberfläche wird geschnitten, bevor der Vorgang wiederholt wird. Auf diese Weise wird ein 3-dimensionaler (3D) Bildblock erzeugt, während das Gewebe weggeschnitten wird. Dieses Bildgebungssystem profitiert zusätzlich von der automatisierten Natur des Geräts, so dass das Mikroskop während des Bildgebungsprozesses unbeaufsichtigt gelassen werden kann, wobei die automatisierte Sammlung von Hunderten von Bildern an einem einzigen Tag möglich ist.

Während die SBF-REM-Bildgebung in erster Linie rückgestreute Elektronen verwendet, um ein Bild der Blockfläche zu bilden, werden während des Bildgebungsprozesses Sekundärelektronen erzeugt12. Sekundärelektronen können sich neben rückgestreuten und Primärstrahlelektronen, die dem Block nicht entkommen, ansammeln und eine “Gewebeladung” erzeugen, die zu einem lokalisierten elektrostatischen Feld an der Blockfläche führen kann. Diese Elektronenakkumulation kann das Bild verzerren oder dazu führen, dass Elektronen aus dem Block ausgestoßen werden und zum vom Rückstreudetektor gesammelten Signal beitragen, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis13verringert wird. Während das Niveau der Gewebeladung durch Verringerung der Elektronenstrahlspannung oder -intensität oder durch Verkürzung der Strahlverweilzeit verringert werden kann, führt dies zu einem verringerten Signal-Rausch-Verhältnis14. Wenn ein Elektronenstrahl mit geringerer Spannung oder Intensität verwendet wird oder der Strahl nur für einen kürzeren Zeitraum in jedem Pixelraum verweilen darf, werden weniger rückgestreute Elektronen aus dem Gewebe ausgestoßen und vom Elektronendetektor eingefangen, was zu einem schwächeren Signal führt. Denk und Horstmann lösten dieses Problem, indem sie Wasserdampf in die Kammer einführten und so die Ladung in der Kammer und auf der Blockfläche auf Kosten der Bildauflösung reduzierten. Bei einem Kammerdruck von 10-100 Pa wird ein Teil des Elektronenstrahls gestreut, was zu Bildrauschen und Auflösungsverlust beiträgt, dies erzeugt jedoch auch Ionen in der Probenkammer, die die Ladung innerhalb des Probenblocks2neutralisieren. Neuere Methoden zur Neutralisierung der Ladung innerhalb des Probenblocks verwenden die fokale Gasinjektion von Stickstoff über die Blockfläche während der Bildgebung oder die Einführung negativer Spannung in die SBF-REM-Stufe, um die Sondenstrahl-Lading-Energie zu verringern und das gesammelte Signal zu erhöhen6,7,15. Anstatt Stufenvorspannung, Kammerdruck oder lokalisierte Stickstoffinjektion einzuführen, um den Ladungsaufbau auf der Blockoberfläche zu verringern, ist es auch möglich, die Leitfähigkeit des Harzes zu erhöhen, indem Kohlenstoff in die Harzmischung eingeführt wird, was aggressivere Bildgebungseinstellungen ermöglicht16. Das folgende allgemeine Protokoll ist eine Adaption des 2010 veröffentlichten Deerinck et al.-Protokolls und deckt Modifikationen an Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethoden ab, die wir für die Minimierung der Gewebeaufladung bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der hochauflösenden Bilderfassung für nützlich hielten3,17,18,19. Während sich das zuvor erwähnte Protokoll auf die Gewebeverarbeitung und Schwermetallimprägnierung konzentrierte, bietet dieses Protokoll Einblicke in den Bildgebungs-, Datenanalyse- und Rekonstruktionsworkflow, der SBF-SEM-Studien innewohnt. In unserem Labor wurde dieses Protokoll erfolgreich und reproduzierbar auf eine Vielzahl von Geweben angewendet, darunter Hornhaut- und Vordersegmentstrukturen, Augenlid, Tränen- und Härterdrüse, Netzhaut und Sehnerv, Herz, Lunge und Atemwege, Niere, Leber, Cremaster-Muskel und Großhirnrinde / Medulla sowie in einer Vielzahl von Arten wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Fisch, Monoschicht- und Stratifizierte Zellkulturen, Schwein, nichtmenschliche Primaten sowie Menschen20,21,22,23. Während sich kleine Änderungen für bestimmte Gewebe und Anwendungen lohnen können, hat sich dieses allgemeine Protokoll im Kontext unserer Core Imaging Facility als sehr reproduzierbar und nützlich erwiesen.

Protocol

Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien behandelt, die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research und den Richtlinien des University of Houston College of Optometry für den Umgang mit Tieren beschrieben sind. Alle Tierverfahren wurden von den Institutionen genehmigt, in denen sie behandelt wurden: Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen- und nichtmenschliche Primatenverfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Univer…

Representative Results

Maus HornhautDieses Protokoll wurde ausgiebig auf die Hornhaut der Maus angewendet. Mit Hilfe der SBF-SEM-Bildgebung wurde gezeigt, dass ein Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillenbündeln (EFMBs) in der erwachsenen Maushornhaut vorhanden ist. Bisher glaubte man, dass dieses Netzwerk nur während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung vorhanden war. SBF-SEM zeigte ein ausgedehntes EFMB-Netzwerk in der gesamten Hornhaut, wobei einzelne Fasern bei Der Messung im Querschnitt einen Durchme…

Discussion

Der Zweck dieses Methodenpapiers besteht darin, die Gewebevorbereitungs- und Bildgebungsmethodik hervorzuheben, die es unserem Labor ermöglicht hat, hochauflösende serielle Elektronenmikroskopiebilder zuverlässig zu erfassen, und kritische Schritte aufzuzeigen, die zu diesem Ergebnis führen, sowie mögliche Fallstricke, die bei der Durchführung der SBF-REM-Bildgebung auftreten können. Der Erfolg mit diesem Protokoll erfordert die richtige Fixierung des Gewebes, die Imprägnierung von Schwermetallen in die Probe, Mo…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown und Margaret Gondo für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Forschung wurde teilweise von den National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 und P30 EY007551 (National Eye Institute), teilweise von der Lion’s Foundation for Sight und teilweise von NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development) unterstützt.

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
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Referências

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)Heavy Metal StainingResin InfiltrationAutomated Image Capture
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Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
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