JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה שגרתית לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים טורי (SBF-SEM), טכניקת הדמיה תלת-ממדית רבת עוצמה. יישום מוצלח של צירי SBF-SEM על קיבוע נאות וטכניקות כתמי רקמות, כמו גם שיקול זהיר של הגדרות הדמיה. פרוטוקול זה מכיל שיקולים מעשיים לממותו של תהליך זה.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתי (SBF-SEM) מאפשר איסוף של מאות עד אלפי תמונות אולטרה-מבניות הרשומות באופן סדרתי, ומציע תצוגה תלת מימדית חסרת תקדים של מיקרואנטומיה של רקמות. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו. מערכת הדמיה זו נהנית מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד. עם זאת, ללא הכנת רקמות מתאימה אולטרה מובנה הסלולר ניתן לשנות באופן כזה מסקנות שגויות או מטעות עשוי להסיק. בנוסף, תמונות נוצרות על ידי סריקת פני הבלוק של מדגם ביולוגי מוטבע שרף וזה לעתים קרובות מציג אתגרים ושיקולים שיש לטפל בהם. הצטברות אלקטרונים בתוך הבלוק במהלך ההדמיה, המכונה “טעינת רקמות”, עלולה להוביל לאובדן ניגודיות ולחוסר יכולת להעריך את המבנה התאי. יתר על כן, בעוד הגדלת עוצמת קרן אלקטרונים / מתח או הפחתת מהירות סריקת קרן יכול להגביר את רזולוציית התמונה, זה יכול להיות גם תופעת לוואי מצערת של פגיעה בלוק שרף ועיוות התמונות הבאות בסדרת ההדמיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול שגרתי להכנת דגימות רקמה ביולוגית המשמרת את המבנה התאי ומפחיתה את טעינת הרקמות. כמו כן, אנו מספקים שיקולי הדמיה לרכישה מהירה של תמונות סדרתיות באיכות גבוהה עם נזק מינימלי לגוש הרקמות.

Introduction

בלוק סדרתי פנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) תואר לראשונה על ידי לייטון בשנת 1981 שבו הוא עיצב מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה בתוספת מיקרוטום מובנה אשר יכול לחתוך תמונה חלקים דקים של רקמה מוטבע שרף. למרבה הצער, מגבלות טכניות הגבילו את השימוש בו לדגימות מוליכות, שכן דגימות לא מוליכות כגון רקמה ביולוגית צברו רמות בלתי קבילות של טעינה (הצטברות אלקטרונים בתוך דגימת הרקמה)1. בעוד ציפוי הפנים בלוק בין חתכים עם פחמן התאדה מופחת טעינת רקמות, זה גדל מאוד זמן רכישת הדמיה ואחסון תמונה נשאר בעיה כמו טכנולוגיית המחשב באותו זמן לא היה מספיק כדי לנהל את גדלי הקבצים הגדולים שנוצרו על ידי המכשיר. מתודולוגיה זו נבחנה מחדש על ידי דנק והורסטמן בשנת 2004 באמצעות SBF-SEM המצויד בתא לחץ משתנה2. זה איפשר הכנסת אדי מים לתא ההדמיה אשר מפחית את הטעינה בתוך המדגם, מה שהופך את ההדמיה של דגימות לא מוליך קיימא אם כי עם אובדן רזולוציית תמונה. שיפורים נוספים בשיטות הכנת רקמות והדמיה מאפשרים כעת הדמיה באמצעות ואקום גבוה, והדמיה SBF-SEM כבר לא מסתמכת על אדי מים כדי לפזר טעינה3,4,5,6,7,8,9. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו.

SBF-SEM מאפשר איסוף אוטומטי של אלפי תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הרשומות באופן סדרתי, עם רזולוציה מישורית קטנה כמו 3-5 ננומטר10,11. רקמה, ספוגה במתכות כבדות ומוטבעת שרף, ממוקמת בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) המכיל ultramicrotome מצויד בסכין יהלום. משטח שטוח נחתך עם סכין היהלומים, הסכין נסוגה, ומשטח הבלוק נסרק בתבנית רסטר עם קרן אלקטרונים כדי ליצור תמונה של מבנה רקמות. לאחר מכן הבלוק מועלה סכום שצוין (למשל, 100 ננומטר) בציר z, המכונה “z-step”, ומשטח חדש נחתך לפני שהתהליך חוזר על עצמו. בדרך זו בלוק תלת מימדי (3D) של תמונות מופק כמו הרקמה נחתכת. מערכת הדמיה זו נהנית עוד יותר מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד.

בעוד הדמיית SBF-SEM משתמשת בעיקר אלקטרונים backscattered כדי ליצור תמונה של פני הבלוק, אלקטרונים משניים נוצרים במהלך תהליך ההדמיה12. אלקטרונים משניים יכולים להצטבר, לצד אלקטרונים עם קורות אחוריות ופני קרן ראשונית שאינם נמלטים מהחסימה, ומייצרים “טעינת רקמות”, מה שעלול להוביל לשדה אלקטרוסטטי מקומי בפני הבלוק. הצטברות אלקטרונים זו יכולה לעוות את התמונה או לגרום אלקטרונים להיפלט מהבלוק ולתרום לאות שנאסף על ידי גלאי backscatter, הפחתת יחס אות לרעש13. בעוד שניתן להפחית את רמת טעינת הרקמות על ידי הפחתת המתח או העוצמה של קרן האלקטרונים, או הפחתת זמן השתהות בקרן, התוצאה היא יחס אות לרעש מופחת14. כאשר נעשה שימוש בקרן אלקטרונים במתח נמוך יותר או בעוצמה נמוכה יותר, או כאשר הקרן רשאית להתעכב בתוך כל מרחב פיקסלים רק לפרק זמן קצר יותר, אלקטרונים פחות מכווצים לאחור נפלטים מהרקמה ונלכדים על ידי גלאי האלקטרונים וכתוצאה מכך אות חלש יותר. דנק והורסטמן התמודדו עם בעיה זו על ידי החדרת אדי מים לתא, ובכך להפחית את המטען בתא ועל פני הבלוק במחיר של רזולוציית תמונה. עם לחץ תא של 10-100 Pa, חלק מקרן האלקטרונים מפוזר תורם רעש תמונה ואובדן רזולוציה, אולם זה גם מייצר יונים בתא הדגימה אשר מנטרל תשלום בתוך בלוק מדגם2. שיטות עדכניות יותר לנטרול מטען בתוך בלוק המדגם להשתמש הזרקת גז מוקדי של חנקן על פני הבלוק במהלך ההדמיה, או החדרת מתח שלילי לשלב SBF-SEM כדי להקטין את האנרגיה מטען קרן בדיקה ולהגדיל את האות שנאסף6,7,15. במקום להציג הטיית במה, לחץ תאי או הזרקת חנקן מקומית כדי להפחית את הצטברות הטעינה על משטח הבלוק, ניתן גם להגדיל את המוליכות של השרף על ידי החדרת פחמן לתערובת השרף המאפשרת הגדרות הדמיה אגרסיביות יותר16. הפרוטוקול הכללי הבא הוא התאמה של פרוטוקול Deerinck et al. שפורסם בשנת 2010 ומכסה שינויים במתודולוגיות הכנת רקמות והדמיה שמצאנו שימושי למזעור טעינת רקמות תוך שמירה על רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה3,17,18,19. בעוד שהפרוטוקול שהוזכר לעיל התמקד בעיבוד רקמות ובהסתמעת מתכות כבדות, פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי זרימת העבודה של ההדמיה, ניתוח הנתונים והשחזור הטבועה במחקרי SBF-SEM. במעבדה שלנו, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה ובאופן שכפול על מגוון רחב של רקמות כולל קרנית ומבני קטעים לפני השימוש, עפעפיים, בלוטות קריליות וקשות יותר, רשתית ועצב הראייה, לב, ריאות ודרכי הנשימה, כליות, כבד, שריר קרמאסטר וקליפת המוח /medulla, ובמגוון מינים כולל עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, דגים, מונולאייר ותרביות תאים מרובדות, חזיר, פרימטים לא אנושיים, כמו גם בניאדם 20,21,22,23. בעוד שינויים קטנים עשויים להיות כדאי עבור רקמות ויישומים ספציפיים, פרוטוקול כללי זה הוכיח מאוד לשחזור ושימושי בהקשר של מתקן ההדמיה הליבה שלנו.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו על פי ההנחיות המתוארות בהצהרת האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים בראייה ומחקר עיניים ובהנחיות הטיפול בבעלי חיים של מכללת יוסטון לאופטומטריה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי המוסדות שבהם הם טופלו: עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, נהלי פרימטים שאינם אנושיים א?…

Representative Results

עכבר קרניתפרוטוקול זה הוחל בהרחבה על הקרנית של העכבר. באמצעות SBF-SEM הדמיה רשת של חבילות microfibril נטול אלסטין (EFMBs) הוצגו להיות נוכח בתוך הקרנית העכבר הבוגר. בעבר האמינו כי רשת זו הייתה נוכחת רק במהלך התפתחות עוברית ותחילת הלידה. SBF-SEM חשף רשת EFMB נרחבת ברחבי הקרנית, עם סיבים בודדים שנמצ…

Discussion

מטרת נייר שיטות זה היא להדגיש את הכנת הרקמות ואת מתודולוגיית ההדמיה שאיפשרה למעבדה שלנו ללכוד באופן אמין תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים סדרתיות ברזולוציה גבוהה, ולהצביע על צעדים קריטיים שמובילים לתוצאה זו, כמו גם מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הדמיית SBF-SEM. הצלחה בשימוש בפר?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד”ר סם הנלון, אוולין בראון ומרגרט גונדו על הסיוע הטכני המצוין שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 EY-018239 ו P30 EY007551 (המכון הלאומי לבריאות הילד), בין השאר על ידי קרן האריה למראה, ובחלקו על ידי NIH 1R15 HD084262-01 (המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם).

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we–where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neurociência. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Tags

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)Heavy Metal StainingResin InfiltrationAutomated Image Capture
check_url/pt/62045?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image