I denne studien beskriver vi prosessen med T-lymfocyttisolasjon fra ferske prøver av forkalkede aortaventiler og de analytiske trinnene i T-cellekloning for karakterisering av adaptive leukocyttundergrupper ved hjelp av strømningscytometrianalyse.
Calcific aorta ventil sykdom (CAVD), en aktiv sykdomsprosess som spenner fra mild fortykning av ventilen til alvorlig forkalkning, er forbundet med høy dødelighet, til tross for nye terapeutiske alternativer som transkateter aortaventil erstatning (TAVR).
De komplette veiene som starter med ventilforkalkning og fører til alvorlig aortastenose forblir bare delvis forstått. Ved å gi en nær representasjon av aortaventilcellene in vivo, kan analysen av T-lymfocytter fra stenotisk ventilvev være en effektiv måte å avklare deres rolle i utviklingen av forkalkning. Etter kirurgisk eksisjon dissekeres den ferske aortaventilprøven i små biter, og T-lymfocyttene dyrkes, klones og analyseres deretter ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
Fargingsprosedyren er enkel og de fargede rørene kan også festes ved hjelp av 0,5% av paraformaldehyd og analyseres opptil 15 dager senere. Resultatene generert fra fargingspanelet kan brukes til å spore endringer i T-cellekonsentrasjoner over tid i forhold til intervensjon og kan enkelt videreutvikles for å vurdere aktiveringstilstander av spesifikke T-celleundertyper av interesse. I denne studien viser vi isolasjonen av T-celler, utført på ferske forkalkede aortaventilprøver og trinnene for å analysere T-cellekloner ved hjelp av strømningscytometri for å forstå rollen som adaptiv immunitet i CAVD patofysiologi.
Calcific aortaklaffsykdom (CAVD) er en av de vanligste hjerteklaffforstyrrelsene, med stor innvirkning på helsevesenet. Hyppigheten av aortaventilerstatning de siste årene har økt dramatisk og forventes å øke ytterligere på grunn av den voksende eldre befolkningen1.
Den underliggende patofysiologien til CAVD er bare delvis kjent, og de nåværende terapeutiske strategiene er begrenset til konservative tiltak eller aortaventilerstatning, enten gjennom kirurgiske eller perkutane prosedyrer. Til dags dato kan ingen effektiv medisinsk behandling hindre eller reversere CAVD-progresjon og høy dødelighet er forbundet med tidlig symptomstart, med mindre aortaventilerstatning (AVR) utføres2. Hos pasienter med alvorlig symptomatisk aortastenose ble den 3-årige symptomfrie overlevelsen rapportert så lavt som 20%3. Transkateter aortaventilerstatning (TAVR) representerer et nytt alternativ, revolusjonerende behandling for høyrisikopasienter, spesielt blant eldre og har dramatisk redusert dødeligheten, som var iboende høy i denne befolkningen4,5,6. Til tross for de lovende resultatene fra TAVR, er videre forskning nødvendig for å forstå CAVD patofysiologi for å identifisere nye tidlige terapeutiske mål7,8,9.
Tidligere antatt å være en passiv, degenerativ prosess, er CAVD nå anerkjent som en aktiv progressiv sykdom, preget av en osteoblastisk fenotypebryter av aortaventilen interstitielle celler10. Denne sykdommen innebærer progressiv mineralisering, fibrokaltiske endringer og redusert bevegelighet av aortaventilbrosjyrene (sklerose), som til slutt hindrer blodstrømmen som fører til innsnevring (stenose) av aortaventilåpningen11.
Betennelse betraktes som en nøkkelprosess i CAVD patofysiologi, som ligner prosessen med vaskulær aterosklerose. Endotelskade muliggjør avsetning og akkumulering av lipidarter, spesielt oksidert lipoproteiner i aortaventilen12. Disse oksiderte lipoproteinene provoserer en inflammatorisk respons, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktiviteten som fører til mineralisering. Rollen som medfødt og adaptiv immunitet i CAVD-utvikling og sykdomsprogresjon har nylig blitt fremhevet13. Aktivering og klonisk utvidelse av spesifikke undergrupper av minne T-celler er dokumentert hos pasienter med CAVD og mineraliserte aortaventilbrosjyrer, slik at inflammatoriske prosesser antas å være involvert i det minste i utviklingen av CAVD og antagelig i sykdomsprogresjon også14. Faktisk, selv om antigen-presenterende celler og makrofager er til stede i både den sunne og syke ventilen, er tilstedeværelsen av T-lymfocytter indikativ for en alderen og syk aortaventil. Denne lymfocytiske infiltraten sammen med en økning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på CAVD15.
Vi hypoteser eksistensen av en interaksjon mellom aortaventilens interstitialceller og aktiveringen av immunsystemet, noe som potensielt utløser initiering av en kronisk inflammatorisk prosess i aortaventilen. Analysen av T-celler fra stenotisk aortaventilvev kan være en effektiv måte å avklare sin rolle i forkalkningsutvikling, da det kan gi en nær representasjon av aortaventilcellene in vivo. I det nåværende arbeidet, ved hjelp av aortaventilvev, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem, og karakteriserer dem deretter ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Ferske aortaventilprøver ble utskilt fra CAVD-pasienter som fikk kirurgisk ventilerstatning for alvorlig aortastenose. Etter kirurgisk eksisjon ble den ferske ventilprøven dissekert i små biter og T-cellene ble dyrket, klonet og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Fargingsprosedyren er enkel og de fargede rørene kan festes ved hjelp av 0,5% av paraformaldehyd og analyseres opptil 15 dager senere. Dataene som genereres fra fargingspanelet kan brukes til å spore endringer i T-lymfocyttfordeling over tid i forhold til intervensjon og kan enkelt videreutvikles for å vurdere aktiveringstilstander av spesifikke T-celledelsett av interesse.
Utvinning av forkalket vev, isolering av leukocytter fra forkalket vev og spesielt bruk av strømningscytometri på denne typen vev kan være utfordrende, på grunn av problemer som autofluorescence. Det finnes få publikasjoner med protokoller for dette spesifikke formålet16,17,18. Her presenterer vi en protokoll designet spesielt for direkte isolasjon og kultur av T-lymfocytt fra humane aortaventilprøver. Clonal utvidelse av lymfocytter er et kjennetegn på adaptiv immunitet. Å studere denne prosessen in vitro gir innsiktsfull informasjon om nivået av lymfocytt heterogenitet19. Etter en tre ukers inkubasjonsperiode er T-celleklonene klare til å bli fremskyndet, da en tilstrekkelig mengde T-celler fra hver klone ble oppnådd, for å tillate fenotypisk og funksjonell studie. Deretter studeres fenotypen av T-kloner ved cytofluorometri.
Denne immunologiske protokollen er en tilpasning av en metode som tidligere ble utviklet av Amedei et al. for T-celleisolasjon og karakterisering fra humant vev, spesielt designet for forkalket menneskelig vev, for eksempel i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering av PBMCer (perifere blodmonykleære celler) ved hjelp av bestrålet buffy coat beskriver en effektiv måte å skaffe materceller (FC), spesielt justert for kloningsfasen av T-lymfocytter isolert fra ventilinterstitielle celler. Materlaget består av i vekst arresterte celler, som fortsatt er levedyktige og bioaktive. Matercellens rolle er viktig for å støtte in vitro overlevelse og vekst av T-lymfocytter isolert fra ventilinterstitielle celler23. For å unngå spredning av materceller i kulturen, må disse cellene gjennomgå en vekststans. Dette kan oppnås på to måter: gjennom fysiske metoder som bestråling, eller gjennom behandling med cytotoksiske kjemikalier, som mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotika som kan påføres direkte på kulturoverflaten24. Her viser vi matercellevekst arrestasjon oppnådd gjennom cellebestråling.
Denne metoden presenterer en effektiv, kostnadseffektiv måte å isolere og karakterisere T-celler fra aortaventilvev, noe som bidrar til å utvide spekteret av immunologiske metoder for å utforske CAVD patofysiologi.
Her presenterer vi en metode for å karakterisere T-lymfocytt subpopulations isolert fra stenotiske aortaventilprøver, ved hjelp av strømningscytometri. Denne metoden krever bruk av bestrålet buffy frakk for å isolere PBMCene. Strålingsfrekvensen som de buffy frakkposene må utsettes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det representerer et avgjørende skritt for å stoppe spredningen av matercellene. Cellenes rolle isolert fra de buffy frakkposene er å fungere bare som materceller og gi næringsstoffer til T-cellene …
The authors have nothing to disclose.
Alle de buffy frakkposene som ble brukt til denne protokollen ble bestrålet takket være tilgjengeligheten til Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer og hele teamet til Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Stipendholder/Mary Roxana Christopher, dette arbeidet støttes av et stipend fra Det tyske hjerteselskapet (DGK).
50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |