Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri
Summary
Vi presenterar ett protokoll för identifiering och kvantifiering av stora klasser av vattenlösliga metaboliter i jästen Saccharomyces cerevisiae. Den beskrivna metoden är mångsidig, robust och känslig. Det möjliggör separation av strukturella isomerer och stereoisomeriska former av vattenlösliga metaboliter från varandra.
Abstract
Metabolomik är en metod som används för identifiering och kvantifiering av många lågmolekylära intermediärer och metabolismprodukter inom cell, vävnad, organ, biologisk vätska eller organism. Metabolomik fokuserar traditionellt på vattenlösliga metaboliter. Den vattenlösliga metabolomen är slutprodukten av ett komplext mobilnät som integrerar olika genomiska, epigenomiska, transkriptomiska, proteomiska och miljömässiga faktorer. Därför bedömer den metabolomiska analysen direkt resultatet av åtgärden för alla dessa faktorer i en mängd biologiska processer inom olika organismer. En av dessa organismer är den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae, en encellig eukaryote med det helt sekvenserade genomet. Eftersom S. cerevisiae är mottaglig för omfattande molekylära analyser, används det som en modell för dissekeringsmekanismer som ligger till grund för många biologiska processer inom eukaryota cellen. En mångsidig analysmetod för en robust, känslig och korrekt kvantitativ bedömning av den vattenlösliga metabolomen skulle ge den viktigaste metoden för att dissekera dessa mekanismer. Här presenterar vi ett protokoll för optimerade villkor för metabolisk aktivitetssläckning i och vattenlöslig metabolit extraktion från S. cerevisiae celler. Protokollet beskriver också användningen av flytande kromatografi i kombination med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av extraherade vattenlösliga metaboliter. LC-MS/MS-metoden för icke-riktad metabolomik som beskrivs här är mångsidig och robust. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper, inklusive olika strukturella isomerer och stereoisomeriska former av dessa metaboliter. Dessa metaboliter inkluderar olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylcykel intermediärer. LC-MS/MS-metoden för icke-riktad metabolomik är känslig och gör det möjligt att identifiera och kvantifiera vissa vattenlösliga metaboliter vid koncentrationer så låga som 0,05 pmol/μL. Metoden har framgångsrikt använts för att bedöma vattenlösliga metabolomer av vilda och mutanta jästceller odlade under olika förhållanden.
Introduction
Vattenlösliga metaboliter är lågmolekylära intermediärer och produkter av metabolism som bidrar till väsentliga cellulära processer. Dessa evolutionärt bevarade processer inkluderar omvandling av näringsämnen till användbar energi, syntes av makromolekyler, cellulär tillväxt och signalering, cellcykelkontroll, reglering av genuttryck, stressrespons, postöversättningsreglering av metabolism, underhåll av mitokondriell funktionalitet, fordonscellshandel, autofagi, cellulärt åldrande och reglerad celldöd1,2,3.
Många av dessa väsentliga roller av vattenlösliga metaboliter har upptäckts genom studier i den spirande jästen S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denna encelliga eukaryote är en användbar modellorganism för dissekeringsmekanismer genom vilka vattenlösliga metaboliter bidrar till cellulära processer på grund av dess mottaglighet för avancerade biokemiska, genetiska och molekylärbiologiska analyser23,24,25,26. Även om LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik har använts för att studera rollerna för vattenlösliga metaboliter i spirande jäst3,18,22,27, kräver denna typ av analys förbättring av dess mångsidighet, robusthet, känslighet och förmåga att skilja mellan olika strukturella isomererer och stereoisomeriska former av dessa metaboliter.
De senaste åren kännetecknas av betydande framsteg vid tillämpning av LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik vid profilering av vattenlösliga metaboliter in vivo. Många utmaningar med att använda denna metod är dockfortfarande 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Dessa utmaningar inkluderar följande. För det första ligger de intracellulära koncentrationerna av många vattenlösliga metaboliter under ett tröskelvärde för känslighet för de nuvarande metoderna. För det andra är effektiviteten av metabolisk aktivitetssläckning för låg, och omfattningen av släckningsrelaterade cellläckage av intracellulära metaboliter är för hög för nuvarande metoder; De metoder som för närvarande används underskattar därför de intracellulära koncentrationerna av vattenlösliga metaboliter. För det tredje kan de befintliga metoderna inte skilja mellan de strukturella isomererna (dvs. molekyler med samma kemiska formel men olika atomanslutning) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samma kemiska formel och atomanslutning, men med de olika atomarrangemangen i rymden) hos specifika metaboliter. Detta förhindrar korrekt anteckning av vissa metaboliter med de nuvarande metoderna. För det fjärde är de befintliga masspektrala onlinedatabaserna för föräldrajoner (MS1) och sekundärjoner (MS2) ofullständiga. Detta påverkar korrekt identifiering och kvantifiering av specifika metaboliter med hjälp av de råa LC-MS/MS-data som produceras med hjälp av de nuvarande metoderna. För det femte kan de befintliga metoderna inte använda en enda typ av metabolitextraktion för att återställa alla eller de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter. För det sjätte kan de befintliga metoderna inte använda en enda typ av LC-kolumnen för att skilja alla eller de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter från varandra.
Här optimerade vi villkoren för släckning av metabolisk aktivitet inom S. cerevisiae celler, upprätthålla de flesta av de vattenlösliga metaboliter inom dessa celler före extraktion, och extrahera de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter från jästceller. Vi utvecklade en mångsidig, robust och känslig metod för LC-MS/MS-baserad identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter extraherade från S. cerevisiae celler. Denna metod för icke-målinriktad metabolomik gör det möjligt att bedöma intracellulära koncentrationer av olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylic cykel intermediärer. Den utvecklade LC-MS/MS-metoden gör det möjligt att identifiera och kvantifiera olika strukturella isomererer och stereoisomeriska former av vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Följ de förebyggande åtgärder som beskrivs nedan för att framgångsrikt använda protokollet som beskrivs här. Kloroform och metanol extraherar olika ämnen från laboratorieplastartiklar. Hantera dem därför med försiktighet. Undvik användning av plast i steg som innebär kontakt med något av dessa två organiska lösningsmedel. Använd borosilikatglaspipetter för dessa steg. Jäs dessa pipetter med kloroform och metanol före användning. Använd endast mikropipettespetsar och rör av polypropylen som är re…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot nuvarande och tidigare medlemmar av Titorenkolaboratoriet för diskussioner. Vi bekräftar Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Centre for Structural and Functional Genomics och Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alla vid Concordia University) för enastående tjänster. Denna studie stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada (RGPIN 2014-04482 och CRDPJ 515900 – 17). K.M. stöddes av Concordia University Armand C. Archambault Fellowship och Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
Referências
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genética. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genética. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genética. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
