Vi presenterar ett protokoll för identifiering och kvantifiering av stora klasser av vattenlösliga metaboliter i jästen Saccharomyces cerevisiae. Den beskrivna metoden är mångsidig, robust och känslig. Det möjliggör separation av strukturella isomerer och stereoisomeriska former av vattenlösliga metaboliter från varandra.
Metabolomik är en metod som används för identifiering och kvantifiering av många lågmolekylära intermediärer och metabolismprodukter inom cell, vävnad, organ, biologisk vätska eller organism. Metabolomik fokuserar traditionellt på vattenlösliga metaboliter. Den vattenlösliga metabolomen är slutprodukten av ett komplext mobilnät som integrerar olika genomiska, epigenomiska, transkriptomiska, proteomiska och miljömässiga faktorer. Därför bedömer den metabolomiska analysen direkt resultatet av åtgärden för alla dessa faktorer i en mängd biologiska processer inom olika organismer. En av dessa organismer är den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae, en encellig eukaryote med det helt sekvenserade genomet. Eftersom S. cerevisiae är mottaglig för omfattande molekylära analyser, används det som en modell för dissekeringsmekanismer som ligger till grund för många biologiska processer inom eukaryota cellen. En mångsidig analysmetod för en robust, känslig och korrekt kvantitativ bedömning av den vattenlösliga metabolomen skulle ge den viktigaste metoden för att dissekera dessa mekanismer. Här presenterar vi ett protokoll för optimerade villkor för metabolisk aktivitetssläckning i och vattenlöslig metabolit extraktion från S. cerevisiae celler. Protokollet beskriver också användningen av flytande kromatografi i kombination med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av extraherade vattenlösliga metaboliter. LC-MS/MS-metoden för icke-riktad metabolomik som beskrivs här är mångsidig och robust. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper, inklusive olika strukturella isomerer och stereoisomeriska former av dessa metaboliter. Dessa metaboliter inkluderar olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylcykel intermediärer. LC-MS/MS-metoden för icke-riktad metabolomik är känslig och gör det möjligt att identifiera och kvantifiera vissa vattenlösliga metaboliter vid koncentrationer så låga som 0,05 pmol/μL. Metoden har framgångsrikt använts för att bedöma vattenlösliga metabolomer av vilda och mutanta jästceller odlade under olika förhållanden.
Vattenlösliga metaboliter är lågmolekylära intermediärer och produkter av metabolism som bidrar till väsentliga cellulära processer. Dessa evolutionärt bevarade processer inkluderar omvandling av näringsämnen till användbar energi, syntes av makromolekyler, cellulär tillväxt och signalering, cellcykelkontroll, reglering av genuttryck, stressrespons, postöversättningsreglering av metabolism, underhåll av mitokondriell funktionalitet, fordonscellshandel, autofagi, cellulärt åldrande och reglerad celldöd1,2,3.
Många av dessa väsentliga roller av vattenlösliga metaboliter har upptäckts genom studier i den spirande jästen S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denna encelliga eukaryote är en användbar modellorganism för dissekeringsmekanismer genom vilka vattenlösliga metaboliter bidrar till cellulära processer på grund av dess mottaglighet för avancerade biokemiska, genetiska och molekylärbiologiska analyser23,24,25,26. Även om LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik har använts för att studera rollerna för vattenlösliga metaboliter i spirande jäst3,18,22,27, kräver denna typ av analys förbättring av dess mångsidighet, robusthet, känslighet och förmåga att skilja mellan olika strukturella isomererer och stereoisomeriska former av dessa metaboliter.
De senaste åren kännetecknas av betydande framsteg vid tillämpning av LC-MS/MS-metoderna för icke-riktad metabolomik vid profilering av vattenlösliga metaboliter in vivo. Många utmaningar med att använda denna metod är dockfortfarande 2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Dessa utmaningar inkluderar följande. För det första ligger de intracellulära koncentrationerna av många vattenlösliga metaboliter under ett tröskelvärde för känslighet för de nuvarande metoderna. För det andra är effektiviteten av metabolisk aktivitetssläckning för låg, och omfattningen av släckningsrelaterade cellläckage av intracellulära metaboliter är för hög för nuvarande metoder; De metoder som för närvarande används underskattar därför de intracellulära koncentrationerna av vattenlösliga metaboliter. För det tredje kan de befintliga metoderna inte skilja mellan de strukturella isomererna (dvs. molekyler med samma kemiska formel men olika atomanslutning) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samma kemiska formel och atomanslutning, men med de olika atomarrangemangen i rymden) hos specifika metaboliter. Detta förhindrar korrekt anteckning av vissa metaboliter med de nuvarande metoderna. För det fjärde är de befintliga masspektrala onlinedatabaserna för föräldrajoner (MS1) och sekundärjoner (MS2) ofullständiga. Detta påverkar korrekt identifiering och kvantifiering av specifika metaboliter med hjälp av de råa LC-MS/MS-data som produceras med hjälp av de nuvarande metoderna. För det femte kan de befintliga metoderna inte använda en enda typ av metabolitextraktion för att återställa alla eller de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter. För det sjätte kan de befintliga metoderna inte använda en enda typ av LC-kolumnen för att skilja alla eller de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter från varandra.
Här optimerade vi villkoren för släckning av metabolisk aktivitet inom S. cerevisiae celler, upprätthålla de flesta av de vattenlösliga metaboliter inom dessa celler före extraktion, och extrahera de flesta klasser av vattenlösliga metaboliter från jästceller. Vi utvecklade en mångsidig, robust och känslig metod för LC-MS/MS-baserad identifiering och kvantifiering av mer än 370 vattenlösliga metaboliter extraherade från S. cerevisiae celler. Denna metod för icke-målinriktad metabolomik gör det möjligt att bedöma intracellulära koncentrationer av olika energibärarmolekyler, nukleotider, aminosyror, monosackarider, intermediärer av glykolys och trikarboxylic cykel intermediärer. Den utvecklade LC-MS/MS-metoden gör det möjligt att identifiera och kvantifiera olika strukturella isomererer och stereoisomeriska former av vattenlösliga metaboliter med olika strukturella, fysiska och kemiska egenskaper.
Följ de förebyggande åtgärder som beskrivs nedan för att framgångsrikt använda protokollet som beskrivs här. Kloroform och metanol extraherar olika ämnen från laboratorieplastartiklar. Hantera dem därför med försiktighet. Undvik användning av plast i steg som innebär kontakt med något av dessa två organiska lösningsmedel. Använd borosilikatglaspipetter för dessa steg. Jäs dessa pipetter med kloroform och metanol före användning. Använd endast mikropipettespetsar och rör av polypropylen som är re…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot nuvarande och tidigare medlemmar av Titorenkolaboratoriet för diskussioner. Vi bekräftar Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Centre for Structural and Functional Genomics och Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alla vid Concordia University) för enastående tjänster. Denna studie stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada (RGPIN 2014-04482 och CRDPJ 515900 – 17). K.M. stöddes av Concordia University Armand C. Archambault Fellowship och Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.
Chemicals | |||
Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
L-histidine | Sigma | H8125 | |
L-leucine | Sigma | L8912 | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
Uracil | Sigma | U0750 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Hardware equipment | |||
500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
Digital thermometer | Omega | HH509 | |
Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
Laboratory materials | |||
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
Software | |||
Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
Yeast strain | |||
Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |