Полу количественное определение плотности дофаминергических нейронов в Чернии субстанции моделей грызунов с использованием автоматизированного анализа изображений
Summary
Здесь представлен автоматизированный метод полу количественного определения числа дофаминергических нейронов в крысиной субстанции nigra pars compacta.
Abstract
Оценка количества дофаминергических нейронов в чернии субстанции является ключевым методом в доклинических исследованиях болезни Паркинсона. В настоящее время непредвзятый стереологический подсчет является стандартом для количественной оценки этих клеток, но он остается трудоемким и трудоемким процессом, который может быть неосуществим для всех проектов. Здесь мы описываем использование платформы анализа изображений, которая может точно оценить количество меченых клеток в заранее определенной области интереса. Мы описываем пошаговый протокол для этого метода анализа в мозге крыс и демонстрируем, что он может идентифицировать значительное снижение положительных нейронов тирозингидроксилазы из-за экспрессии мутантного α-синуклеина в черную субстанцию. Мы проверили эту методологию, сравнив с результатами, полученными с помощью непредвзятой стереологии. Взятый вместе, этот метод обеспечивает эффективный по времени и точный процесс обнаружения изменений в количестве дофаминергических нейронов и, таким образом, подходит для эффективного определения влияния вмешательств на выживание клеток.
Introduction
Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным расстройством движения, характеризующимся наличием белковых агрегатов, содержащих α-синуклеин (α-син) и предпочтительной потерей дофаминергических нейронов в субстанции nigra pars compacta (SNpc)1. Количественная оценка числа дофаминергических нейронов является жизненно важной частью исследования БП, поскольку она позволяет оценить целостность нигростриатальной системы, обеспечивая тем самым важную конечную точку для оценки эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. В настоящее время стандартом количественной оценки числа клеток является непредвзятый стереологический подсчет, который использует двумерные (2D) поперечные сечения ткани для оценки объемных особенностей в трехмерных (3D) структурах2,3,4. Современные стереологические методы, основанные на проектировании, используют комплексные процедуры случайной выборки и применяют протоколы подсчета (известные как зонды), чтобы избежать потенциальных артефактов и систематических ошибок, что позволяет надежно обнаруживать различия, лишь немного большие, чем вариации между животными5. Хотя стереология обеспечивает мощный аналитический инструмент для гистологических исследований in vivo, она занимает много времени, предполагает равномерную подготовку образца и требует валидации на нескольких этапах, что может повлиять на эффективность, все более необходимую для доклинического трансляционного исследования.
Последние технологические достижения в цифровой науке позволяют принимать новые приложения для более эффективной оценки патологии без стереомикроскопа, одновременно удовлетворяя потребность в качестве суррогата непредвзятой стереологии. Эти методы увеличивают скорость, уменьшают человеческую ошибку и улучшают воспроизводимость стереологических методов6,7. HALO является одной из таких платформ анализа изображений для количественного анализа тканей в цифровой патологии. Он включает в себя множество различных модулей и сообщает морфологические и мультиплексированные данные экспрессии на клеточной основе по целым участкам ткани с использованием алгоритмов распознавания образов. Модуль cytonuclear FL измеряет иммунофлуоресцентную позитивность флуоресцентных маркеров в ядре или цитоплазме. Это позволяет сообщать о количестве клеток, положительных для каждого маркера, и оценке интенсивности для каждой ячейки. Модуль может быть адаптирован для обеспечения индивидуальных размеров клеток и измерений интенсивности, хотя эта функция не требуется для количественной оценки дофаминергических нейронов.
Целью данного исследования является проверка этого метода с помощью ранее проверенной вирусной векторной модели α-син крыс нигральной нейродегенерации8,9,10. В этой модели человеческий мутант A53T α-syn экспрессируется в SNpc путем стереотаксической инъекции аденоассоциированного вируса гибридного серотипа 1/2 (AAV1/2), что приводит к значительной нейродегенерации в течение 6 недель. Контралатеральный неинъекционный SNpc может, в некоторых исследованиях, служить внутренним контролем для вводимой стороны. Чаще всего инъекция AAV-пустого вектора (AAV-EV) в контрольную когорту животных используется в качестве отрицательного контроля. Мы представляем пошаговое руководство по оценке плотности дофаминергических нейронов, оставшихся в введенном SNpc через 6 недель с использованием автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений(рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Достоверная оценка целостности дофаминергической системы в доклинических моделях БП имеет решающее значение для определения эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. Поэтому важно контролировать и минимизировать потенциальные путаницы, кот?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить всех сотрудников Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) в University Health Network за их время и помощь в разработке этого протокола.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
Referências
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neurociência. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neurociência. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
