Semi-kvantitativ bestemmelse af dopaminergisk neurontæthed i Substantia Nigra af gnavermodeller ved hjælp af automatiseret billedanalyse
Summary
Her præsenterer vi en automatiseret metode til semi-kvantitativ bestemmelse af dopaminergisk neuron nummer i rotte substantia nigra pars compacta.
Abstract
Estimering af antallet af dopaminergiske neuroner i substantia nigra er en nøglemetode i præklinisk Parkinsons sygdomsforskning. I øjeblikket er uvildig stereologisk optælling standarden for kvantificering af disse celler, men det er stadig en besværlig og tidskrævende proces, som måske ikke er mulig for alle projekter. Her beskriver vi brugen af en billedanalyseplatform, som præcist kan estimere mængden af mærkede celler i et foruddefineret interesseområde. Vi beskriver en trin-for-trin protokol for denne analysemetode i rottehjerne og demonstrerer, at den kan identificere en signifikant reduktion i tyrosinhydroxylase positive neuroner på grund af udtryk for mutant α-synuclein i substantia nigra. Vi validerede denne metode ved at sammenligne med resultater opnået ved upartisk stereologi. Samlet set giver denne metode en tidseffektiv og præcis proces til påvisning af ændringer i dopaminergisk neuronnummer og er derfor egnet til effektiv bestemmelse af virkningen af interventioner på celleoverlevelse.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en udbredt neurodegenerativ bevægelsesforstyrrelse karakteriseret ved tilstedeværelsen af proteinaggregater, der indeholder α-synuclein (α-syn) og præferencetabet af dopaminergiske neuroner i substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kvantificering af dopaminergisk neuronnummer er en vigtig del af PD-forskningen, da den gør det muligt at evaluere nigrostriatalsystemets integritet, hvilket giver et vigtigt slutpunkt for at vurdere effektiviteten af potentielle sygdomsmodificerende behandlinger. I øjeblikket er standarden for kvantificering af cellenummer fordomsfri stereologisk optælling, som bruger todimensionelle (2D) tværsnit af væv til at estimere volumetriske funktioner i tredimensionelle (3D) strukturer2,3,4. Moderne designbaserede stereologiske metoder anvender omfattende stikprøveprocedurer og anvender tælleprotokoller (kendt som sonder) for at undgå potentielle artefakter og systematiske fejl, hvilket giver mulighed for pålidelig påvisning af forskelle, der kun er lidt større end variation mellem dyr5. Mens stereologi er et kraftfuldt analyseværktøj til in vivo histologiske undersøgelser, er det tidskrævende, antager ensartet prøveforberedelse og kræver validering på flere trin, hvilket kan påvirke den effektivitet, der i stigende grad kræves til præklinisk translationel undersøgelse.
De seneste teknologiske fremskridt inden for digital videnskab gør det muligt at vedtage nye applikationer til mere effektive vurderinger af patologi uden et stereomikroskop, samtidig med at man udfylder et behov som surrogat for upartisk stereologi. Disse metoder øger hastigheden, reducerer menneskelige fejl og forbedrer reproducerbarheden af stereologiske teknikker6,7. HALO er en sådan billedanalyseplatform for kvantitativ vævsanalyse i digital patologi. Det består af en række forskellige moduler og rapporter morfologiske og multiplekserede udtryksdata på celle-for-celle basis på tværs af hele vævssektioner ved hjælp af mønstergenkendelsesalgoritmer. Det cytonuclear FL-modul måler immunfluorescerende positivitet af fluorescerende markører i kernen eller cytoplasmaet. Dette gør det muligt at rapportere antallet af celler, der er positive for hver markør, og intensitetsscoren for hver celle. Modulet kan tilpasses til at give individuelle cellestørrelser og intensitetsmålinger, selvom denne funktion ikke er nødvendig for kvantificering af dopaminergiske neuroner.
Formålet med denne undersøgelse er at verificere denne metode med en tidligere valideret viral vektorbaseret α-syn rottemodel af nigral neurodegeneration8,9,10. I denne model udtrykkes human mutant A53T α-syn i SNpc ved stereotaktisk injektion af adeno-associeret virushybrid serotype 1/2 (AAV1/2), hvilket resulterer i betydelig neurodegeneration over en periode på 6 uger. Den kontralaterale uindsprøjtede SNpc kan i nogle undersøgelser tjene som en intern kontrol for den injicerede side. Mere almindeligt anvendes injektion af AAV-Tom Vector (AAV-EV) i en kontrolkohorte af dyr som en negativ kontrol. Vi præsenterer en trinvis vejledning til at estimere tætheden af dopaminergiske neuroner, der forbliver i den injicerede SNpc efter 6 uger ved hjælp af en automatiseret billedanalysesoftware (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den pålidelige vurdering af dopaminergisk systems integritet i prækliniske modeller af PD er afgørende for at bestemme effektiviteten af potentielle sygdomsmodificerende behandlinger. Derfor er det vigtigt at kontrollere og minimere potentielle confounds, der kan reducere pålideligheden og reproducerbarheden af histopatologiske data. Omhyggelige kvantitative resultater kan give flere oplysninger end kvalitative eller halv kvantitative beskrivelser alene. Samtidig må vi erkende, at begrænsninger i tid og ressourcer …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke alle ansatte på Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) på University Health Network for deres tid og bistand til at udvikle denne protokol.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
Referências
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neurociência. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neurociência. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
