Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem
Summary
Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.
Abstract
A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é um método-chave na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson. Atualmente, a contagem esqueológica imparcial é o padrão para quantificação dessas células, mas continua sendo um processo trabalhoso e demorado, que pode não ser viável para todos os projetos. Aqui, descrevemos o uso de uma plataforma de análise de imagens, que pode estimar com precisão a quantidade de células rotuladas em uma região de interesse pré-definida. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para este método de análise no cérebro de rato e demonstramos que ele pode identificar uma redução significativa nos neurônios positivos da hidroxilase de tyrosina devido à expressão de α-sinucleína mutante na substantia nigra. Validamos essa metodologia comparando-se com os resultados obtidos pela estereologia imparcial. Em conjunto, este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e, portanto, é adequado para uma determinação eficiente do efeito das intervenções na sobrevivência celular.
Introduction
A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)1. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções transversais bidimensionais (2D) do tecido para estimar características volutivas nas estruturas tridimensionais (3D)2,3,4. Os métodos eserológicos modernos baseados em design empregam procedimentos abrangentes de amostragem aleatória e aplicam protocolos de contagem (conhecidos como sondas) para evitar artefatos potenciais e erros sistemáticos, permitindo uma detecção confiável de diferenças apenas um pouco maior do que a variação inter-animal5. Embora a estereologia forneça uma poderosa ferramenta analítica para estudos histológicos in vivo, é tempo intensivo, assume a preparação uniforme de espécimes, e requer validação em várias etapas, o que pode impactar a eficiência cada vez mais necessária para a investigação translacional pré-clínica.
Os recentes avanços tecnológicos na ciência digital possibilitam a adoção de novas aplicações para avaliações mais eficientes da patologia sem um estereótipo, enquanto preenchem uma necessidade como substituto da estereologia imparcial. Esses métodos aumentam a velocidade, reduzem o erro humano e melhoram a reprodutibilidade das técnicas esteológicas6,7. HALO é uma dessas plataformas de análise de imagem para análise quantitativa de tecidos em patologia digital. Ele compreende uma variedade de diferentes módulos e relata dados de expressão morfológica e multiplexado em uma base celular por célula em seções inteiras de tecido usando algoritmos de reconhecimento de padrões. O módulo FL citonuclear mede a positividade imunofluorescente de marcadores fluorescentes no núcleo ou citoplasma. Isso permite relatar o número de células positivas para cada marcador, e o escore de intensidade para cada célula. O módulo pode ser adaptado para fornecer tamanhos celulares individuais e medidas de intensidade, embora este recurso não seja necessário para quantificação de neurônios dopaminérgicos.
O objetivo deste estudo é verificar este método com um modelo de rato α-syn baseado em vetor viral previamente validado de neurodegeneraçãonigral 8,9,10. Neste modelo, o mutante humano A53T α-syn é expresso no SNpc por injeção estereotática do sorotipo híbrido de vírus associado ao adeno 1/2 (AAV1/2), resultando em neurodegeneração significativa durante um período de 6 semanas. O SNpc não injetado contralateral pode, em alguns estudos, servir como um controle interno para o lado injetado. Mais comumente, a injeção de Vetor AAV-Empty (AAV-EV) em uma coorte de controle de animais é usada como um controle negativo. Apresentamos um guia passo-a-passo para estimar a densidade de neurônios dopaminérgicos remanescentes no SNpc injetado após 6 semanas usando um software automatizado de análise de imagem(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
A avaliação confiável da integridade do sistema dopaminérgico em modelos pré-clínicos de DP é fundamental para determinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Por isso, é importante controlar e minimizar potenciais confusões que possam reduzir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados histopatológicos. Resultados quantitativos cuidadosos podem fornecer mais informações do que descrições qualitativas ou semi-quantitativas. Ao mesmo tempo, devemos reconhecer que as restri?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a todos os funcionários do Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) da University Health Network pelo tempo e assistência no desenvolvimento desse protocolo.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
Referências
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