Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.
En el pasado, los sistemas de modelos epiteliales intestinales se limitaban a líneas celulares transformadas y tejido primario. Estos sistemas modelo tienen limitaciones inherentes ya que los primeros no representan fielmente la fisiología tisular original, y la disponibilidad de los segundos es limitada. Por lo tanto, su aplicación dificulta la investigación fundamental y de desarrollo de fármacos. Los organoides adultos basados en células madre (en adelante denominados organoides) son miniaturas de tejido epitelial normal o enfermo del que se derivan. Se pueden establecer de manera muy eficiente a partir de diferentes regiones del tracto gastrointestinal (GI), tienen capacidad de expansión a largo plazo y simulan respuestas específicas de tejidos y pacientes a los tratamientos in vitro. Aquí, se ha demostrado el establecimiento de monocapas epiteliales derivadas de organoides intestinales junto con métodos para medir la integridad de la barrera epitelial, la permeabilidad y el transporte, la secreción de proteínas antimicrobianas, así como la histología. Además, las monocapas derivadas de organoides intestinales pueden enriquecerse con células madre proliferantes y amplificadoras de tránsito, así como con células epiteliales diferenciadas clave. Por lo tanto, representan un sistema modelo que se puede adaptar para estudiar los efectos de los compuestos en las células diana y su modo de acción. Aunque los cultivos organoides son técnicamente más exigentes que las líneas celulares, una vez establecidos, pueden reducir los fallos en las últimas etapas del desarrollo de fármacos, ya que realmente representan la complejidad del epitelio in vivo y la heterogeneidad entre pacientes.
El epitelio intestinal actúa como una barrera física entre el contenido luminal de los intestinos y el tejido subyacente. Esta barrera comprende una sola capa epitelial de enterocitos principalmente absorbentes que están conectados por uniones estrechas, que establecen fuertes conexiones intercelulares entre las células adyacentes. Estas células forman un revestimiento epitelial polarizado que separa los lados apical (lumen) y basolateral del intestino, al tiempo que regula el transporte paracelular de nutrientes y metabolitos digeridos. Además de los enterocitos, otras células epiteliales importantes como las células caliciformes, paneth y enteroendocrinas también contribuyen a la homeostasis intestinal al producir moco, péptidos antimicrobianos y hormonas, respectivamente. El epitelio intestinal se repone constantemente dividiendo las células madre del receptor 5 positivo (LGR5+) ricas en leucina que contienen repetición que contienen proteína G en el fondo de las criptas intestinales que producen células amplificadoras de tránsito (TA) que migran hacia arriba y se diferencian en otros tipos de células1. La interrupción de la homeostasis epitelial intestinal por factores genéticos y ambientales, como la exposición a alérgenos alimentarios, compuestos medicinales y patógenos microbianos, conduce a la interrupción de la función de barrera intestinal. Estas afecciones causan varias enfermedades intestinales, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la enfermedad celíaca y la toxicidad gastrointestinal inducida por medicamentos2.
Los estudios sobre el epitelio intestinal se realizan utilizando varios sistemas de plataforma in vitro, como insertos de membrana, sistemas de órganos en un chip, cámaras de Ussing y anillos intestinales. Estas plataformas son adecuadas para establecer monocapas epiteliales polarizadas con acceso a los lados apical y basolateral de la membrana, utilizando líneas celulares transformadas o tejido primario como modelos. Aunque las líneas celulares transformadas, como las líneas celulares colorrectal (adeno)carcinoma Caco-2, T84 y HT-29, son capaces de diferenciarse en enterocitos intestinales polarizados o células productoras de moco hasta cierto punto, no son representativas del epitelio in vivo ya que faltan varios tipos de células, y varios receptores y transportadores se expresan aberrantemente3 . Además, como las líneas celulares se derivan de un solo donante, no representan la heterogeneidad entre pacientes y sufren de una complejidad reducida y relevancia fisiológica. Aunque los tejidos primarios utilizados en las cámaras de Ussing y como anillos intestinales son más representativos de la situación in vivo, su disponibilidad limitada, viabilidad a corto plazo y falta de capacidad de expansión los hacen inadecuados como medio para estudios de alto rendimiento (HT).
Los organoides son cultivos epiteliales in vitro establecidos a partir de diferentes órganos como el intestino, el riñón, el hígado, el páncreas y el pulmón. Se ha demostrado que tienen una capacidad de expansión estable a largo plazo, así como una estabilidad genética y fenotípica y, por lo tanto, son miniaturas biológicas representativas del epitelio del órgano original con respuestas fieles a estímulos externos 4,5,6,7,8,9. Los organoides se establecen eficientemente a partir de tejido normal, enfermo, inflamado o canceroso resecado o biopsiado, lo que representa respuestas heterogéneas específicas del paciente 10,11,12,13,14,15,16. Este artículo demuestra cómo establecer monocapas epiteliales intestinales derivadas de cultivos de organoides. Las monocapas se han establecido con éxito a partir de cultivos de organoides del intestino delgado, así como del colon y el recto. Este modelo crea una oportunidad para estudiar el transporte y la permeabilidad de las células epiteliales a los fármacos, así como sus efectos toxicológicos sobre el epitelio. Además, el modelo permite el cocultivo con células inmunes y bacterias para estudiar sus interacciones con el epitelio intestinal 17,18,19. Además, este modelo se puede utilizar para estudiar las respuestas a las terapias de una manera específica del paciente e iniciar esfuerzos de detección para buscar la próxima ola de terapias centradas en la barrera epitelial. Tal enfoque podría extenderse a la clínica y allanar el camino hacia tratamientos personalizados.
Aunque las monocapas epiteliales en este protocolo se preparan a partir de organoides intestinales normales humanos, el protocolo se puede aplicar y optimizar para otros modelos de organoides. Las monocapas organoides epiteliales se cultivan en un medio de expansión organoide intestinal que contiene Wnt para apoyar la proliferación de células madre y representar la composición celular de la cripta intestinal. Los organoides intestinales se pueden enriquecer para tener diferentes destinos epiteliales intestinales, como enterocitos, Paneth, copas y células enteroendocrinas, mediante la modulación de las vías Wnt, Notch y factor de crecimiento epidérmico (EGF). Aquí, después del establecimiento de monocapas en medio de expansión, se conducen hacia células epiteliales intestinales más diferenciadas, como se describió anteriormente 20,21,22,23,24,25. Para fines de detección, dependiendo del modo de acción del compuesto de interés, sus células objetivo y las condiciones experimentales, las monocapas se pueden conducir hacia la composición celular de elección para medir los efectos del compuesto con lecturas funcionales relevantes.
Este protocolo describe la manipulación general y el mantenimiento de los organoides intestinales, así como la preparación y posibles aplicaciones de monocapas epiteliales derivadas de estos organoides. Hasta la fecha, las monocapas se han preparado con éxito a partir del duodeno, el íleon y diferentes regiones de organoides del colon derivados del tejido intestinal normal y previamente inflamado (datos no publicados). La aplicación de monocapas organoides derivadas del paciente facilita el estudio de la función d…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo cuenta con el apoyo de Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) public-private partnerships (PPP) allowance of the Dutch LSH sector with Project number LSHM16021 Organoids as novel tool for toxicology modelling to Hubrecht Organoid Technology (HUB) and HUB internal funding to Disease Modeling and Toxicology department. Agradecemos a los laboratorios de Sabine Middendorp (División de Gastroenterología Pediátrica, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) y Hugo R. de Jonge y Marcel J.C. Bijvelds (Departamento de Gastroenterología y Hepatología, Erasmus MC, Rotterdam) por proporcionar apoyo técnico inicial para establecer monocapas en insertos de membrana.
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |