هنا ، نصف إعداد الطبقات الأحادية الظهارية المعوية المشتقة من الأعضاء البشرية لدراسة وظيفة الحاجز المعوي والنفاذية والنقل. نظرا لأن المواد العضوية تمثل استجابة الأنسجة الظهارية الأصلية للمحفزات الخارجية ، فإن هذه النماذج تجمع بين مزايا قابلية تمدد خطوط الخلايا وأهمية الأنسجة الأولية وتعقيدها.
في الماضي ، كانت أنظمة النماذج الظهارية المعوية تقتصر على خطوط الخلايا المتحولة والأنسجة الأولية. هذه الأنظمة النموذجية لها قيود متأصلة لأن الأولى لا تمثل بأمانة فسيولوجيا الأنسجة الأصلية ، وتوافر الأخير محدود. وبالتالي ، فإن تطبيقها يعيق البحوث الأساسية وتطوير الأدوية. المواد العضوية القائمة على الخلايا الجذعية البالغة (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم المواد العضوية) هي منمنمات من الأنسجة الظهارية الطبيعية أو المريضة التي تشتق منها. يمكن إنشاؤها بكفاءة عالية من مناطق الجهاز الهضمي المختلفة (GI) ، ولها قابلية للتوسع على المدى الطويل ، وتحاكي الاستجابات الخاصة بالأنسجة والمريض للعلاجات في المختبر. هنا ، تم إثبات إنشاء طبقات أحادية ظهارية مشتقة من الأمعاء العضوية جنبا إلى جنب مع طرق لقياس سلامة الحاجز الظهاري ، والنفاذية والنقل ، وإفراز البروتين المضاد للميكروبات ، وكذلك علم الأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن إثراء الطبقات الأحادية المشتقة من المواد العضوية المعوية بالخلايا الجذعية المنتشرة والخلايا المضخمة العابرة وكذلك بالخلايا الظهارية الرئيسية المتباينة. لذلك ، فهي تمثل نظاما نموذجيا يمكن تصميمه لدراسة آثار المركبات على الخلايا المستهدفة وطريقة عملها. على الرغم من أن الثقافات العضوية أكثر تطلبا من الناحية الفنية من خطوط الخلايا ، إلا أنها بمجرد إنشائها ، يمكنها تقليل الفشل في المراحل اللاحقة من تطوير الدواء لأنها تمثل حقا تعقيد ظهارة الجسم الحي وعدم التجانس بين المرضى.
تعمل الظهارة المعوية كحاجز مادي بين المحتوى اللمعاني للأمعاء والأنسجة الكامنة. يتكون هذا الحاجز من طبقة ظهارية واحدة من الخلايا المعوية الاستيعابية بشكل رئيسي والتي ترتبط بتقاطعات ضيقة ، والتي تنشئ روابط قوية بين الخلايا بين الخلايا المتجاورة. تشكل هذه الخلايا بطانة ظهارية مستقطبة تفصل بين الجانبين القمي (التجويف) والقاعدي الجانبي للأمعاء ، بينما تنظم في نفس الوقت النقل شبه الخلوي للمغذيات والأيضات المهضومة. بالإضافة إلى الخلايا المعوية ، تساهم الخلايا الظهارية المهمة الأخرى مثل الكأس والبانيث والخلايا المعوية الصماوية أيضا في التوازن المعوي عن طريق إنتاج المخاط والببتيدات المضادة للميكروبات والهرمونات ، على التوالي. يتم تجديد الظهارة المعوية باستمرار عن طريق تقسيم الخلايا الجذعية الغنية بالليوسين التي تحتوي على بروتين G المقترن بالبروتين 5 إيجابية (LGR5 +) في الجزء السفلي من الخبايا المعوية التي تنتج خلايا تضخيم العبور (TA) التي تهاجر لأعلى وتتمايز إلى أنواع أخرى من الخلايا1. يؤدي اضطراب التوازن الظهاري المعوي بسبب العوامل الوراثية والبيئية ، مثل التعرض لمسببات الحساسية الغذائية والمركبات الطبية ومسببات الأمراض الميكروبية ، إلى تعطيل وظيفة الحاجز المعوي. تسبب هذه الحالات العديد من الأمراض المعوية بما في ذلك مرض التهاب الأمعاء (IBD) ومرض الاضطرابات الهضمية وسمية الجهاز الهضمي الناجمة عن الأدوية2.
يتم إجراء الدراسات على الظهارة المعوية باستخدام العديد من أنظمة المنصات في المختبر مثل إدراج الغشاء ، وأنظمة الأعضاء على رقاقة ، وغرف الاستخدام ، والحلقات المعوية. هذه المنصات مناسبة لإنشاء طبقات أحادية ظهارية مستقطبة مع إمكانية الوصول إلى كل من الجوانب القمية والقاعدية الجانبية للغشاء ، باستخدام خطوط الخلايا المحولة أو الأنسجة الأولية كنماذج. على الرغم من أن خطوط الخلايا المتحولة ، مثل خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم (الغدي) Caco-2 و T84 و HT-29 ، قادرة على التمايز إلى خلايا معوية معوية مستقطبة أو خلايا منتجة للمخاط إلى حد ما ، إلا أنها لا تمثل ظهارة الجسم الحي حيث أن العديد من أنواع الخلايا مفقودة ، ويتم التعبير عن المستقبلات والناقلات المختلفة بشكل شاذ3 . بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن خطوط الخلايا مشتقة من متبرع واحد ، فإنها لا تمثل عدم تجانس بين المرضى وتعاني من انخفاض التعقيد والأهمية الفسيولوجية. على الرغم من أن الأنسجة الأولية المستخدمة في غرف Ussing وكحلقات معوية أكثر تمثيلا للحالة في الجسم الحي ، إلا أن توافرها المحدود وقابليتها للحياة على المدى القصير وعدم قابليتها للتوسع يجعلها غير مناسبة كوسيلة للدراسات عالية الإنتاجية (HT).
المواد العضوية هي في الثقافات الظهارية المختبرية التي أنشئت من أعضاء مختلفة مثل الأمعاء والكلى والكبد والبنكرياس والرئة. وقد ثبت أن لديها قابلية توسع طويلة الأجل ومستقرة بالإضافة إلى الاستقرار الوراثي والمظهري ، وبالتالي فهي منمنمات بيولوجية تمثيلية لظهارة العضو الأصلي مع استجابات مخلصة للمحفزات الخارجية4،5،6،7،8،9. يتم إنشاء المواد العضوية بكفاءة من الأنسجة الطبيعية أو المريضة أو الملتهبة أو السرطانية المستأنفة أو المستأنفة أو المستوفاة ، والتي تمثل استجابات غير متجانسة خاصة بالمريض10،11،12،13،14،15،16. توضح هذه الورقة كيفية إنشاء طبقات أحادية ظهارية معوية مشتقة من الثقافات العضوية. تم إنشاء الطبقات الأحادية بنجاح من الثقافات العضوية المعوية الصغيرة وكذلك القولون والمستقيم. يخلق هذا النموذج فرصة لدراسة انتقال الخلايا الظهارية ونفاذيتها إلى الأدوية وكذلك آثارها السمية على الظهارة. علاوة على ذلك ، يسمح النموذج للزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية والبكتيريا بدراسة تفاعلاتها مع الظهارة المعوية 17،18،19. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الاستجابات للعلاجات بطريقة خاصة بالمريض وبدء جهود الفحص للبحث عن الموجة التالية من العلاجات التي تركز على الحواجز الظهارية. يمكن توسيع نطاق هذا النهج ليشمل العيادة ويمهد الطريق نحو علاجات شخصية.
على الرغم من أن الطبقات الأحادية الظهارية في هذا البروتوكول يتم إعدادها من المواد العضوية المعوية الطبيعية البشرية ، إلا أنه يمكن تطبيق البروتوكول وتحسينه للنماذج العضوية الأخرى. يتم استزراع الطبقات الأحادية العضوية الظهارية في وسط توسع عضوي معوي يحتوي على Wnt لدعم تكاثر الخلايا الجذعية وتمثيل التركيب الخلوي للسرداب المعوي. يمكن إثراء المواد العضوية المعوية للحصول على مصائر ظهارية معوية مختلفة ، مثل الخلايا المعوية ، و Paneth ، و goblet ، والخلايا الصماء المعوية ، عن طريق تعديل مسارات Wnt و Notch و Epidermal Growth factor (EGF). هنا ، بعد إنشاء طبقات أحادية في وسط التمدد ، يتم دفعها نحو خلايا ظهارية معوية أكثر تمايزا ، كما هو موضح سابقا20،21،22،23،24،25. لأغراض الفحص ، اعتمادا على طريقة عمل المركب محل الاهتمام ، وخلاياه المستهدفة ، والظروف التجريبية ، يمكن دفع الطبقات الأحادية نحو التركيب الخلوي المفضل لقياس تأثيرات المركب مع القراءات الوظيفية ذات الصلة.
يصف هذا البروتوكول التلاعب العام وصيانة المواد العضوية المعوية بالإضافة إلى التحضير والتطبيقات المحتملة للطبقات الأحادية الظهارية المشتقة من هذه المواد العضوية. حتى الآن ، تم إعداد الطبقات الأحادية بنجاح من الاثني عشر والدقاق ومناطق مختلفة من عضويات القولون المشتقة من الأنسجة المعوية …
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم هذا العمل من قبل Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI ) للشراكات بين القطاعين العام والخاص (PPP) بدل قطاع LSH الهولندي مع رقم المشروع LSHM16021 Organoids كأداة جديدة لنمذجة علم السموم لتكنولوجيا Hubrecht Organoid Technology (HUB) والتمويل الداخلي HUB لقسم نمذجة الأمراض والسموم. نشكر مختبرات سابين ميدندورب (قسم أمراض الجهاز الهضمي لدى الأطفال ، مستشفى فيلهلمينا للأطفال ، UMC ، أوتريخت) وهوغو ر. دي جونغ ومارسيل جي سي بيجلدز (قسم أمراض الجهاز الهضمي والكبد ، Erasmus MC ، روتردام) على تقديم الدعم الفني الأولي لإعداد طبقات أحادية على إدراج الغشاء.
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |