Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell’espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.
In passato, i sistemi modello epiteliali intestinali erano limitati alle linee cellulari trasformate e al tessuto primario. Questi sistemi modello hanno limitazioni intrinseche in quanto i primi non rappresentano fedelmente la fisiologia tissutale originale e la disponibilità del secondo è limitata. Quindi, la loro applicazione ostacola la ricerca fondamentale e lo sviluppo di farmaci. Gli organoidi a base di cellule staminali adulte (d’ora in poi denominati organoidi) sono miniature di tessuto epiteliale normale o malato da cui derivano. Possono essere stabiliti in modo molto efficiente da diverse regioni del tratto gastrointestinale (GI), avere espandibilità a lungo termine e simulare risposte tessuto-specifiche e del paziente ai trattamenti in vitro. Qui, è stata dimostrata la creazione di monostrati epiteliali derivati da organoidi intestinali insieme a metodi per misurare l’integrità della barriera epiteliale, la permeabilità e il trasporto, la secrezione proteica antimicrobica e l’istologia. Inoltre, i monostrati derivati dagli organoidi intestinali possono essere arricchiti con cellule staminali proliferanti e che amplificano il transito, nonché con cellule epiteliali differenziate chiave. Pertanto, rappresentano un sistema modello che può essere adattato per studiare gli effetti dei composti sulle cellule bersaglio e la loro modalità d’azione. Sebbene le colture organoidi siano tecnicamente più esigenti delle linee cellulari, una volta stabilite, possono ridurre i fallimenti nelle fasi successive dello sviluppo del farmaco in quanto rappresentano veramente la complessità dell’epitelio in vivo e l’eterogeneità interpaziente.
L’epitelio intestinale agisce come una barriera fisica tra il contenuto luminale dell’intestino e il tessuto sottostante. Questa barriera comprende un singolo strato epiteliale di enterociti principalmente assorbenti che sono collegati da giunzioni strette, che stabiliscono forti connessioni intercellulari tra cellule adiacenti. Queste cellule formano un rivestimento epiteliale polarizzato che separa i lati apicale (lume) e basolaterale dell’intestino, regolando contemporaneamente il trasporto paracellulare di nutrienti e metaboliti digeriti. Oltre agli enterociti, anche altre importanti cellule epiteliali come calice, paneth e cellule enteroendocrine contribuiscono all’omeostasi intestinale producendo rispettivamente muco, peptidi antimicrobici e ormoni. L’epitelio intestinale viene costantemente reintegrato dividendo le cellule staminali del recettore 5-positivo (LGR5+) contenenti ripetizioni ricche di leucina nel fondo delle cripte intestinali producendo cellule che amplificano il transito (TA) che migrano verso l’alto e si differenziano in altri tipi di cellule1. L’interruzione dell’omeostasi epiteliale intestinale da parte di fattori genetici e ambientali, come l’esposizione ad allergeni alimentari, composti medicinali e agenti patogeni microbici, porta all’interruzione della funzione di barriera intestinale. Queste condizioni causano diverse malattie intestinali tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD), la celiachia e la tossicità GI indotta da farmaci2.
Gli studi sull’epitelio intestinale vengono eseguiti utilizzando diversi sistemi di piattaforma in vitro come inserti a membrana, sistemi organ-on-a-chip, camere di Ussing e anelli intestinali. Queste piattaforme sono adatte per stabilire monostrati epiteliali polarizzati con accesso sia ai lati apicali che basolaterali della membrana, utilizzando linee cellulari trasformate o tessuto primario come modelli. Sebbene le linee cellulari trasformate, come le linee cellulari del carcinoma del colon-retto (adeno)Carcinoma Caco-2, T84 e HT-29, siano in grado di differenziarsi in enterociti intestinali polarizzati o cellule produttrici di muco in una certa misura, non sono rappresentative dell’epitelio in vivo poiché mancano diversi tipi di cellule e vari recettori e trasportatori sono espressi in modo aberrante3 . Inoltre, poiché le linee cellulari sono derivate da un singolo donatore, non rappresentano l’eterogeneità interpaziente e soffrono di ridotta complessità e rilevanza fisiologica. Sebbene i tessuti primari utilizzati nelle camere di Ussing e come anelli intestinali siano più rappresentativi della situazione in vivo, la loro limitata disponibilità, vitalità a breve termine e mancanza di espandibilità li rendono inadatti come mezzo per studi ad alto rendimento (HT).
Gli organoidi sono colture epiteliali in vitro stabilite da diversi organi come intestino, rene, fegato, pancreas e polmone. Hanno dimostrato di avere espandibilità stabile a lungo termine e stabilità genetica e fenotipica e quindi sono miniature biologiche rappresentative dell’epitelio dell’organo originale con risposte fedeli agli stimoli esterni 4,5,6,7,8,9. Gli organoidi sono stabiliti in modo efficiente da tessuto resecato o biopsiato normale, malato, infiammato o canceroso, rappresentando risposte eterogenee specifiche del paziente 10,11,12,13,14,15,16. Questo articolo dimostra come stabilire monostrati epiteliali intestinali derivati da colture organoidiche. I monostrati sono stati stabiliti con successo da colture organoidi dell’intestino tenue e del colon e del retto. Questo modello crea l’opportunità di studiare il trasporto e la permeabilità delle cellule epiteliali ai farmaci, nonché i loro effetti tossicologici sull’epitelio. Inoltre, il modello consente la co-coltura con cellule immunitarie e batteri per studiare le loro interazioni con l’epitelio intestinale 17,18,19. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare le risposte alle terapie in modo specifico per il paziente e avviare gli sforzi di screening per cercare la prossima ondata di terapie focalizzate sulla barriera epiteliale. Un tale approccio potrebbe essere esteso alla clinica e aprire la strada a trattamenti personalizzati.
Sebbene i monostrati epiteliali in questo protocollo siano preparati da organoidi intestinali normali umani, il protocollo può essere applicato e ottimizzato per altri modelli organoidi. I monostrati organoidi epiteliali vengono coltivati in un mezzo di espansione organoide intestinale contenente Wnt per supportare la proliferazione delle cellule staminali e rappresentare la composizione cellulare della cripta intestinale. Gli organoidi intestinali possono essere arricchiti per avere diversi destini epiteliali intestinali, come enterociti, Paneth, calice e cellule enteroendocrine, modulando le vie Wnt, Notch e fattore di crescita epidermico (EGF). Qui, dopo la costituzione di monostrati nel mezzo di espansione, sono spinti verso cellule epiteliali intestinali più differenziate, come descritto in precedenza 20,21,22,23,24,25. Ai fini dello screening, a seconda della modalità d’azione del composto di interesse, delle sue cellule bersaglio e delle condizioni sperimentali, i monostrati possono essere guidati verso la composizione cellulare scelta per misurare gli effetti del composto con letture funzionali pertinenti.
Questo protocollo descrive la manipolazione generale e il mantenimento degli organoidi intestinali, nonché la preparazione e le possibili applicazioni di monostrati epiteliali derivati da questi organoidi. Ad oggi, i monostrati sono stati preparati con successo dal duodeno, dall’ileo e da diverse regioni di organoidi del colon derivati dal tessuto intestinale normale e precedentemente e attivamente infiammato (dati non pubblicati). L’applicazione di monostrati organoidi derivati dal paziente facilita lo studio della fun…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato dal Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) public-private partnerships (PPP) allowances del settore olandese LSH con numero di progetto LSHM16021 Organoids come nuovo strumento per la modellazione tossicologica alla Hubrecht Organoid Technology (HUB) e finanziamenti interni HUB al dipartimento di modellazione e tossicologia delle malattie. Ringraziamo i laboratori di Sabine Middendorp (Divisione di Gastroenterologia Pediatrica, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) e Hugo R. de Jonge e Marcel J.C. Bijvelds (Dipartimento di Gastroenterologia ed Epatologia, Erasmus MC, Rotterdam) per aver fornito il supporto tecnico iniziale per la realizzazione di monostrati su inserti a membrana.
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |