Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.
Geçmişte, intestinal epitel model sistemleri transforme hücre hatları ve primer doku ile sınırlıydı. Bu model sistemler, birincisi orijinal doku fizyolojisini sadık bir şekilde temsil etmediğinden ve ikincisinin mevcudiyeti sınırlı olduğundan, doğal sınırlamalara sahiptir. Bu nedenle, uygulamaları temel ve ilaç geliştirme araştırmalarını engellemektedir. Yetişkin kök hücre bazlı organoidler (bundan böyle organoidler olarak anılacaktır), türetildikleri normal veya hastalıklı epitel dokusunun minyatürleridir. Farklı gastrointestinal (GI) sistem bölgelerinden çok verimli bir şekilde kurulabilirler, uzun süreli genişletilebilirliğe sahiptirler ve in vitro tedavilere doku ve hastaya özgü yanıtları simüle ederler. Burada, intestinal organoid kaynaklı epitel monokatmanlarının oluşumu, epitel bariyer bütünlüğünü, geçirgenliği ve transportunu, antimikrobiyal protein sekresyonunu ve histolojiyi ölçme yöntemleri ile birlikte gösterilmiştir. Ayrıca, bağırsak organoidinden türetilmiş tek katmanlar, çoğalan kök ve transit yükseltici hücrelerin yanı sıra anahtar farklılaşmış epitel hücreleri ile zenginleştirilebilir. Bu nedenle, bileşiklerin hedef hücreler üzerindeki etkilerini ve etki biçimlerini incelemek için uyarlanabilecek bir model sistemi temsil ederler. Organoid kültürler teknik olarak hücre hatlarından daha zorlu olsalar da, bir kez kurulduktan sonra, in vivo epitel karmaşıklığını ve hastalar arası heterojenliği gerçekten temsil ettikleri için ilaç geliştirmenin sonraki aşamalarındaki başarısızlıkları azaltabilirler.
Bağırsak epiteli, bağırsakların luminal içeriği ile altta yatan doku arasında fiziksel bir bariyer görevi görür. Bu bariyer, bitişik hücreler arasında güçlü hücreler arası bağlantılar kuran sıkı kavşaklarla bağlanan esas olarak emici enterositlerin tek bir epitel tabakasını içerir. Bu hücreler, bağırsağın apikal (lümen) ve bazolateral taraflarını ayıran polarize bir epitel astarı oluştururken, aynı zamanda sindirilmiş besinlerin ve metabolitlerin parasellüler taşınmasını düzenler. Enterositlere ek olarak, kadeh, paneth ve enteroendokrin hücreler gibi diğer önemli epitel hücreleri de sırasıyla mukus, antimikrobiyal peptitler ve hormonlar üreterek bağırsak homeostazına katkıda bulunur. Bağırsak epiteli, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-proteini eşleşmiş reseptör 5-pozitif (LGR5 +) kök hücrelerinin, yukarı doğru göç eden ve diğer hücre tiplerine farklılaşan geçiş-yükseltici (TA) hücreler üreten bağırsak kriptlerinin dibinde bölünmesiyle sürekli olarak yenilenir1. İntestinal epitel homeostazının gıda alerjenlerine, tıbbi bileşiklere ve mikrobiyal patojenlere maruz kalma gibi genetik ve çevresel faktörlerle bozulması, bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulmasına yol açar. Bu koşullar, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), çölyak hastalığı ve ilaca bağlı GI toksisitesi 2 dahil olmak üzere çeşitli bağırsak hastalıklarına nedenolur.
Bağırsak epiteli ile ilgili çalışmalar, membran ekleri, çip üzerindeki organlar, Ussing odaları ve bağırsak halkaları gibi çeşitli in vitro platform sistemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu platformlar, membranın hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişimi olan, dönüştürülmüş hücre hatlarını veya birincil dokuyu model olarak kullanan polarize epitel monokatmanları oluşturmak için uygundur. Kolorektal (adeno) karsinom hücre hatları Caco-2, T84 ve HT-29 gibi dönüştürülmüş hücre hatları, polarize bağırsak enterositlerine veya mukus üreten hücrelere bir dereceye kadar farklılaşabilse de, birkaç hücre tipi eksik olduğundan ve çeşitli reseptörler ve taşıyıcılar anormal bir şekilde ifade edildiğinden in vivo epiteli temsil etmezler3 . Ek olarak, hücre hatları tek bir donörden türetildiğinden, hastalar arası heterojenliği temsil etmezler ve karmaşıklığın ve fizyolojik ilginin azalmasından muzdariptirler. Ussing odalarında ve bağırsak halkaları olarak kullanılan birincil dokular in vivo durumu daha iyi temsil etse de, sınırlı kullanılabilirlikleri, kısa süreli canlılıkları ve genişletilebilirlik eksikliği, onları yüksek verimli (HT) çalışmalar için bir ortam olarak uygun hale getirmemektedir.
Organoidler bağırsak, böbrek, karaciğer, pankreas ve akciğer gibi farklı organlardan kurulan in vitro epitel kültürleridir. Uzun vadeli, stabil genişleyen ve genetik ve fenotipik stabiliteye sahip oldukları kanıtlanmıştır ve bu nedenle orijinal organın epitelinin temsili biyolojik minyatürleridir ve dış uyaranlara sadık tepkiler verirler 4,5,6,7,8,9. Organoidler, heterojen hastaya özgü yanıtları temsil eden normal, hastalıklı, iltihaplı veya kanserli dokudan rezeke edilmiş veya biyopsi yapılmış 10,11,12,13,14,15,16 etkili bir şekilde kurulur. Bu yazıda organoid kültürlerden türetilen intestinal epitel monokatmanlarının nasıl oluşturulacağı gösterilmektedir. Tek katmanlı maddeler ince bağırsakların yanı sıra kolonik ve rektal organoid kültürlerden de başarıyla kurulmuştur. Bu model, epitel hücrelerinin ilaçlara taşınmasını ve geçirgenliğini ve epitel üzerindeki toksikolojik etkilerini incelemek için bir fırsat yaratır. Dahası, model, bağışıklık hücreleri ve bakterilerle birlikte kültürün bağırsak epiteli ile etkileşimlerini incelemesine izin verir17,18,19. Ayrıca, bu model tedavilere verilen yanıtları hastaya özgü bir şekilde incelemek ve epitel bariyer odaklı terapötiklerin bir sonraki dalgasını aramak için tarama çabalarını başlatmak için kullanılabilir. Böyle bir yaklaşım kliniğe genişletilebilir ve kişiselleştirilmiş tedavilere giden yolu açabilir.
Bu protokoldeki epitel monokatmanları insan normal bağırsak organoidlerinden hazırlanmış olsa da, protokol diğer organoid modeller için uygulanabilir ve optimize edilebilir. Epitelyal organoid monokatmanlar, kök hücre proliferasyonunu desteklemek ve bağırsak kript hücresel kompozisyonunu temsil etmek için Wnt içeren intestinal organoid genişleme ortamında kültürlenir. Bağırsak organoidleri, Wnt, Notch ve epidermal büyüme faktörü (EGF) yollarını modüle ederek enterositler, Paneth, kadeh ve enteroendokrin hücreler gibi farklı bağırsak epitel kaderlerine sahip olacak şekilde zenginleştirilebilir. Burada, genleşme ortamında tek katmanların kurulmasından sonra, daha önce tarif edildiği gibi daha farklılaşmış bağırsak epitel hücrelerine doğru yönlendirilirler20,21,22,23,24,25. Tarama amacıyla, ilgilenilen bileşiğin etki şekline, hedef hücrelerine ve deneysel koşullara bağlı olarak, tek katmanlar, bileşiğin etkilerini ilgili fonksiyonel okumalarla ölçmek için tercih edilen hücresel bileşime doğru yönlendirilebilir.
Bu protokol, bağırsak organoidlerinin genel manipülasyonunu ve bakımını ve ayrıca bu organoidlerden türetilen epitel monokatmanlarının hazırlanmasını ve olası uygulamalarını açıklar. Bugüne kadar, monokatmanlar, normal, daha önce ve aktif olarak iltihaplı bağırsak dokusundan türetilen duodenum, ileum ve kolon organoidlerinin farklı bölgelerinden başarıyla hazırlanmıştır (yayınlanmamış veriler). Hasta kaynaklı organoid monokatmanların uygulanması, bariyer fonksiyonunun hastalığa ve …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Hollanda LSH sektörünün Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) kamu-özel sektör ortaklıkları (PPP) ödeneği tarafından desteklenmektedir LSHM16021 Proje numarası ile Hubrecht Organoid Teknolojisine (HUB) toksikoloji modellemesi için yeni bir araç olarak Organoidler ve Hastalık Modelleme ve Toksikoloji departmanına HUB iç finansmanı. Sabine Middendorp (Pediatrik Gastroenteroloji Bölümü, Wilhelmina Çocuk Hastanesi, UMC, Utrecht) ve Hugo R. de Jonge ve Marcel J.C. Bijvelds (Gastroenteroloji ve Hepatoloji Bölümü, Erasmus MC, Rotterdam) laboratuvarlarına, membran eklerinde tek katmanlı tabakalar kurmak için ilk teknik desteği sağladıkları için teşekkür ederiz.
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |