Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen
Summary
Een multi-kolom plaatadapter maakt het mogelijk om chromatografiekolommen te koppelen aan multi-well verzamelplaten voor parallelle affiniteit of ionenuitwisselingszuivering, wat een economische eiwitzuiveringsmethode met hoge doorvoer biedt. Het kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm het leveren van milligram hoeveelheden eiwit via betaalbare instrumentatie.
Abstract
Eiwitzuivering is essentieel voor de studie van eiwitstructuur en -functie en wordt meestal gebruikt in combinatie met biofysische technieken. Het is ook een belangrijk onderdeel in de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Het evoluerende tijdperk van functionele proteomics voedt de vraag naar eiwitzuivering met hoge doorvoer en verbeterde technieken om dit te vergemakkelijken. Er werd verondersteld dat een multi-kolom plaatadapter (MCPA) meerdere chromatografiekolommen van verschillende harsen kan koppelen aan multi-well platen voor parallelle zuivering. Deze methode biedt een economische en veelzijdige methode van eiwitzuivering die kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm, die wedijvert met de snelheid van een geautomatiseerd systeem. De MCPA kan worden gebruikt om milligram opbrengsten van eiwitten te herstellen door middel van een betaalbare en tijd efficiënte methode voor latere karakterisering en analyse. De MCPA is gebruikt voor affiniteitszuivering met hoge doorvoer van SH3-domeinen. Ionenuitwisseling is ook aangetoond via de MCPA om eiwitten te zuiveren na Ni-NTA affiniteitschromatografie, wat aangeeft hoe dit systeem kan worden aangepast aan andere zuiveringstypen. Door de opstelling met meerdere kolommen kan individuele aanpassing van parameters in dezelfde zuivering worden gemaakt, onhaalbaar door de huidige plaatgebaseerde methoden.
Introduction
Eiwitzuiveringstechnieken om milligramhoeveelheden gezuiverde eiwitten te bereiken zijn noodzakelijk voor hun karakterisering en analyse, vooral voor biofysische methoden zoals NMR. Eiwitzuivering staat ook centraal in andere studiegebieden, zoals geneesmiddelenontdekkingsprocessen en eiwit-eiwitinteractiestudies; het bereiken van dergelijke hoeveelheden zuiver eiwit kan echter een knelpunt worden voor deze technieken1,2,3. De belangrijkste methode voor eiwitzuivering is chromatografie, die een verscheidenheid aan methoden omvat die afhankelijk zijn van de individuele kenmerken van eiwitten en hun tags. Bij affiniteitschromatografie hebben eiwitten een extra eiwit- of peptidemotief dat werkt als een tag die affiniteit heeft voor een bepaald substraat op de chromatografiehars4. De meest voorkomende affiniteitsmethode is geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) met behulp van his-gelabelde eiwitten, terwijl een andere populaire methode ionenuitwisselingschromatografie is die eiwitten scheidt op basis van hun lading. Voor de hoogste zuiverheid wordt vaak een combinatie van affiniteitschromatografie en ionenuitwisseling samen gebruikt, waarbij meestal dure laboratoriumapparatuur nodig is voor een hoge doorvoer.
Het evoluerende tijdperk van functionele proteomica voedt de vraag naar technieken met een hoge doorvoersnelheid voor het zuiveren van niet-enkelvoudige eiwitten voor specifieke analyse, maar grote aantallen eiwitten tegelijkertijd voor uitgebreide analyse en genoombrede studies5. Geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) is een van de meest gebruikte methoden voor eiwitzuivering met hoge doorvoer6,7, maar de geautomatiseerde systemen zijn duur en onbetaalbaar voor kleinere laboratoria8. De meer betaalbare plaatgebaseerde alternatieven die momenteel beschikbaar zijn, maken gebruik van toegankelijke laboratoriumapparatuur, zoals een vacuüm. Hoewel deze methoden succesvol zijn in het verbeteren van de zuiveringssnelheid, kan het alleen op kleinere schaal een zuivering met hoge doorvoer bereiken, waardoor alleen eiwitten in het microgrambereik worden opgeleverd. Deze beperkingen betekenen dat de voorverpakte 96 putfilterplaten (bijv. van GE Healthcare die nu eigendom zijn van Cytiva) niet kunnen worden gebruikt vóór biofysische technieken9. Zwaartekrachtchromatografie is de meest kostenefficiënte zuiveringsmethode; het instellen van meerdere kolommen is echter lastig en kan gevoelig zijn voor fouten voor meerdere eiwitten.
Een multi kolom plaat adapter (MCPA) is ontwikkeld en bewezen om met succes en gemakkelijk parallelle affiniteit chromatografie kolommen in een keer uit te voeren om zijn gelabelde gist SH3 domeinen te zuiveren10. De MCPA biedt een kostenefficiënte zuiveringsmethode met hoge doorvoer die niet afhankelijk is van dure instrumentatie. Het flexibele ontwerp kan effectief zuiveren milligram eiwit door meerdere affiniteit chromatografie kolommen onder zwaartekracht of vacuümspruitstuk. Bovendien kunnen harstype, volume en andere parameters voor elke afzonderlijke kolom worden aangepast voor snellere optimalisatie. Deze studie toont aan dat ionenuitwisselingschromatografie door de MCPA kan worden gebruikt in combinatie met affiniteitschromatografie door de MCPA om de zuivering van het Abp1 SH3-domein te verbeteren. Bovendien kunnen tot 24 verschillende eiwitten parallel worden gescheiden met behulp van deze methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode is robuust en eenvoudig te gebruiken voor relatief onervaren eiwit biochemici, maar er zijn een paar overwegingen om in gedachten te houden.
Let op bij overvulling van verzamelplaten
De 48-put opvangplaat zelf bevat slechts 5 ml per put, terwijl elke 96-put slechts 2 ml bevat. Dit moet in gedachten worden gehouden bij het toevoegen van buffer en het uitvoeren van monster door de kolom, omdat er het risico bestaat dat de putten worden over…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door een Institutional Development Award (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer P20GM103451 en een interne onderzoeksbeurs van de Universiteit van Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
Referências
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
