मल्टी-कॉलम प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली
Summary
एक बहु-कॉलम प्लेट एडाप्टर क्रोमेटोग्राफी कॉलम को समानांतर आत्मीयता या आयन विनिमय शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी संग्रह प्लेटों के साथ इंटरफेस करने की अनुमति देता है जो किफायती उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण विधि प्रदान करता है। इसका उपयोग गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम उपज मिलीग्राम मात्रा में किफायती इंस्ट्रूमेंटेशन के माध्यम से किया जा सकता है।
Abstract
प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटीन संरचना और कार्य के अध्ययन के लिए जरूरी है और आमतौर पर जैव भौतिक तकनीकों के संयोजन में प्रयोग किया जाता है। यह भी नए चिकित्सा विज्ञान के विकास में एक महत्वपूर्ण घटक है । कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स का विकसित युग इस सुविधा के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण और बेहतर तकनीकों की मांग को भड़का रहा है। यह परिकल्पना की गई थी कि एक मल्टी कॉलम प्लेट एडाप्टर (एमसीपीए) समानांतर शुद्धिकरण के लिए बहु-अच्छी प्लेटों के साथ विभिन्न रेजिन के कई क्रोमेटोग्राफी कॉलम को इंटरफेस कर सकता है। यह विधि प्रोटीन शुद्धिकरण की एक किफायती और बहुमुखी विधि प्रदान करती है जिसका उपयोग गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम के तहत किया जा सकता है, जो स्वचालित प्रणाली की गति को प्रतिद्वंद्विता करता है। MCPA बाद के लक्षण वर्णन और विश्लेषण के लिए एक सस्ती और समय कुशल विधि द्वारा प्रोटीन की मिलीग्राम पैदावार को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एमसीपीए का उपयोग SH3 डोमेन के उच्च थ्रूपुट आत्मीयता शुद्धि के लिए किया गया है। आयन एक्सचेंज भी MCPA के माध्यम से प्रोटीन पोस्ट नी-एनटीए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी शुद्ध करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, यह दर्शाता है कि कैसे इस प्रणाली को अंय शुद्धिकरण प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । कई स्तंभों के साथ इसके सेटअप के कारण, मापदंडों का व्यक्तिगत अनुकूलन एक ही शुद्धि में किया जा सकता है, जो वर्तमान प्लेट-आधारित तरीकों से अप्राप्य नहीं है।
Introduction
शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रोटीन शुद्धिकरण तकनीक उनके लक्षण वर्णन और विश्लेषण के लिए जरूरी हैं, विशेष रूप से एनएमआर जैसे जैव भौतिक तरीकों के लिए। प्रोटीन शुद्धिकरण भी अध्ययन के अन्य क्षेत्रों में केंद्रीय है जैसे दवा खोज प्रक्रियाएं और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययन; हालांकि, शुद्ध प्रोटीन की इतनी मात्रा को प्राप्त करना इन तकनीकों के लिए एक अड़चन बन सकता है1,2,3. प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए प्रमुख विधि क्रोमेटोग्राफी है, जिसमें विभिन्न प्रकार के तरीके शामिल हैं जो प्रोटीन की व्यक्तिगत विशेषताओं और उनके टैग पर भरोसा करते हैं। एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी में, प्रोटीन में एक अतिरिक्त प्रोटीन या पेप्टाइड आकृति होती है जो एक टैग के रूप में काम करती है जिसमें क्रोमेटोग्राफी राल4पर एक निश्चित सब्सट्रेट के लिए एक लगाव है। सबसे आम आत्मीयता विधि स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) है जो उसके टैग वाले प्रोटीन का उपयोग करके है, जबकि एक अन्य लोकप्रिय विधि आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी है जो उनके आवेश के आधार पर प्रोटीन को अलग करती है। उच्चतम शुद्धता के लिए, आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और आयन एक्सचेंज का एक संयोजन अक्सर एक साथ उपयोग किया जाता है, आमतौर पर उच्च-थ्रूपुट के लिए महंगे प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है।
कार्यात्मक प्रोटेओमिक्स का विकसित युग विशिष्ट विश्लेषण के लिए एकवचन प्रोटीन को शुद्ध नहीं करने के लिए उच्च थ्रूपुट तकनीकों की मांग को भड़का रहा है, लेकिन व्यापक विश्लेषण और जीनोम व्यापक अध्ययन के लिए एक साथ बड़ी संख्या में प्रोटीन5। स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) उच्च थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है6,7 अभी तक इसकी स्वचालित प्रणालियां छोटी प्रयोगशालाओं के लिए महंगी और सस्ती हैं8। अधिक किफायती प्लेट आधारित विकल्प जो वर्तमान में उपलब्ध हैं, सुलभ प्रयोगशाला-आधारित उपकरणों के उपयोग को नियोजित करते हैं, जैसे कि वैक्यूम। हालांकि ये विधियां शुद्धिकरण की गति में सुधार करने में सफल हैं, लेकिन यह केवल छोटे पैमाने पर उच्च थ्रूपुट शुद्धि प्राप्त कर सकती है, केवल माइक्रोग्राम रेंज में प्रोटीन पैदा कर सकती है। इन सीमाओं का मतलब है कि पूर्व पैक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेटें (उदाहरण के लिए, जीई हेल्थकेयर से अब Cytiva के स्वामित्व में) जैव भौतिक तकनीकों से पहले इस्तेमाल नहीं किया जा सकताहै 9. गुरुत्वाकर्षण क्रोमेटोग्राफी शुद्धि की सबसे अधिक लागत-कुशल विधि है; हालांकि, कई स्तंभों की स्थापना असुविधाजनक है और कई प्रोटीन के लिए त्रुटि के लिए प्रवण हो सकता है ।
एक बहु स्तंभ प्लेट एडाप्टर (MCPA) विकसित किया गया है और सफलतापूर्वक और आसानी से समानांतर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम चलाने के लिए एक बार में अपने टैग खमीर SH3 डोमेन10शुद्ध करने के लिए साबित कर दिया गया है । एमसीपीए एक लागत कुशल उच्च-थ्रूपुट शुद्धिकरण विधि प्रदान करता है जो महंगे इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर नहीं करता है। इसका लचीला डिजाइन गुरुत्वाकर्षण या वैक्यूम के तहत कई आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम द्वारा प्रोटीन के मिलीग्राम को प्रभावी ढंग से शुद्ध कर सकता है। इसके अलावा, तेजी से अनुकूलन के लिए प्रत्येक व्यक्तिगत कॉलम के लिए राल प्रकार, मात्रा और अन्य मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है। यह अध्ययन दर्शाता है कि एमसीपीए द्वारा आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी का उपयोग एबीपी 1 एसएच 3 डोमेन के शुद्धिकरण को बढ़ाने के लिए एमसीपीए द्वारा आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी के साथ किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इन तरीकों का उपयोग करके समानांतर रूप से 24 विभिन्न प्रोटीन को अलग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि अपेक्षाकृत अनुभवहीन प्रोटीन बायोकेमिस्टों के लिए उपयोग करने के लिए मजबूत और सरल है, हालांकि ध्यान में रखने के लिए कुछ विचार हैं।
ओवरफिलिंग कलेक्शन प्लेट्स के बारे में सावधानी
<…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रकाशन में सूचित शोध को अनुदान संख्या P20GM103451 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (IDeA) द्वारा समर्थित किया गया था और लिवरपूल विश्वविद्यालय से एक आंतरिक अनुसंधान अनुदान ।
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
Referências
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