マルチカラムプレートアダプタを用いた経済的で多用途の高スループットタンパク質精製システム
Summary
マルチカラムプレートアダプタにより、クロマトグラフィーカラムを並列アフィニティーまたはイオン交換精製用のマルチウェルコレクションプレートとインターフェースして、経済的に高スループットのタンパク質精製方法を提供します。それは現実的な器械使用によって蛋白質のミリグラム量を得る重力または真空の下で使用することができる。
Abstract
タンパク質の精製は、タンパク質の構造と機能の研究に不可欠であり、通常、生物物理学的手法と組み合わせて使用されます。また、新しい治療薬の開発における重要な要素でもあります。機能性プロテオミクスの進化する時代は、これを容易にするための高スループットタンパク質精製と改良された技術の需要を促進しています。マルチカラムプレートアダプタ(MCPA)は、並列精製のためにマルチウェルプレートを持つ異なる樹脂の複数のクロマトグラフィーカラムをインターフェースできると仮定しました。この方法は、自動化されたシステムの速度に匹敵する、重力または真空の下で使用することができるタンパク質精製の経済的で汎用性の高い方法を提供する。MCPA は、その後の特性評価と分析のための手頃な価格と時間効率の高い方法によってタンパク質のミリグラムの収率を回復するために使用できます。.MCPAはSH3ドメインのハイスループットアフィニティー精製のために使用されている。また、MCPAを介してイオン交換が実証され、タンパク質ポストNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーを精製し、このシステムを他の精製タイプにどのように適合させることができるかを示しています。複数の列を使用した設定により、パラメータの個別カスタマイズは同じ精製で行うことができます。
Introduction
精製タンパク質のミリグラム量を達成するためのタンパク質精製技術は、特にNMRなどの生物物理学的方法において、その特性評価と分析に不可欠です。タンパク質精製は、創薬プロセスやタンパク質とタンパク質相互作用の研究など、他の研究分野の中心でもあります。しかし、このような純粋なタンパク質の量を達成することは、これらの技術1、2、3のボトルネックになる可能性があります。タンパク質精製の主な方法は、タンパク質の個々の特性とそのタグに依存する様々な方法を含むクロマトグラフィーです。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂4上の特定の基質に対する親和性を有するタグとして働く追加のタンパク質またはペプチドモチーフを有する。最も一般的な親和性法は、Hisタグ付きタンパク質を用いた固定化金属親和クロマトグラフィー(IMAC)であるのに対し、別の一般的な方法は、その電荷に基づいてタンパク質を分離するイオン交換クロマトグラフィーである。高純度のため、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換の組み合わせが頻繁に使用され、通常は高スループットのために高価なラボ機器が必要です。
機能性プロテオミクスの進化する時代は、特定の分析のために単数形のタンパク質ではなく、多数のタンパク質を同時に精製して包括的な解析とゲノム全体の研究のために、ハイスループット技術の需要を促進している5。固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)は、高スループットタンパク質精製6、7に最も広く使用されている方法の1つですが、その自動化システムは、より小さな実験室8のために高価で手頃な価格です。現在利用可能な、より手頃な価格のプレートベースの代替品は、真空などのアクセス可能な実験室ベースの機器の使用を採用しています。これらの方法は精製速度の向上に成功しているが、より小さなスケールでしか高スループット精製を達成でき、マイクログラム範囲でタンパク質を生み出すだけである。これらの制限は、プレパックされた96ウェルフィルタープレート(例えば、Cytivaが現在所有しているGEヘルスケアから)を生物物理学的技術の前に使用できないことを意味します。重力クロマトグラフィーは、最もコスト効率の高い精製方法です。ただし、複数の列を設定するのは不便であり、複数のタンパク質ではエラーが発生しやすくなります。
マルチカラムプレートアダプタ(MCPA)が開発され、一度に平行アフィニティークロマトグラフィーカラムを正常かつ便利に実行し、Hisタグ付き酵母SH3ドメイン10を精製することが実証されています。MCPAは費用がかかる器械使用に依存しない費用効率の高い高い効率の精製方法を提供する。その柔軟な設計は、重力または真空マニホールドの下で複数の親和性クロマトグラフィーカラムによって効果的にタンパク質のミリグラムを精製することができます。さらに、樹脂の種類、体積、およびその他のパラメータを個々のカラムごとに調整して、最適化を高速化することができます。この研究は、MCPAによるイオン交換クロマトグラフィーがMCPAによるアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて使用され、Abp1 SH3ドメインの精製を強化できることを示している。さらに、これらの方法を用いて、最大24種類のタンパク質を並列に分離することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、比較的経験の浅いタンパク質生化学者に対して堅牢で使いやすいものですが、留意すべき考慮事項がいくつかあります。
コレクション プレートの過剰充填に関する注意
48ウェルコレクションプレート自体はウェルあたり5mLしか保持しませんが、各96ウェルは2mLしか保持しません。これは、井戸を過剰充填するリスクがある?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本論文では、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の助成番号P20GM103451とリバプール大学の内部研究助成金の機関開発賞(IDeA)によって報告された研究が報告されました。
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
Referências
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