Imagerie des protéines podocytiques Nephrin, Actin et Podocin avec microscopie d’expansion

Summary

La méthode présentée permet la visualisation de protéines cellulaires étiquetées fluorescentes avec microscopie d’expansion conduisant à une résolution de 70 nm sur un microscope conventionnel.

Abstract

La perturbation du filtre glomerular composé de l’endothélium glomerular, de la membrane glomerular de sous-sol et des podocytes, a comme conséquence l’albuminuria. Les processus de pied de podocyte contiennent des faisceaux d’actine qui se lient aux protéines cytosquelettiques d’adaptateur telles que la podocine. Ces protéines adaptateurs, comme la podocine, relient l’épine dorsale du diaphragme fente glomérique, comme la néphrine, au cytosquelette d’actine. L’étude de la localisation et de la fonction de ces protéines podocytiques et d’autres est essentielle à la compréhension du rôle du filtre glomerular dans la santé et la maladie. Le protocole présenté permet à l’utilisateur de visualiser l’actine, la podocine et la néphrine dans les cellules avec imagerie à super résolution sur un microscope conventionnel. Premièrement, les cellules sont tachées d’une technique conventionnelle d’immunofluorescence. Toutes les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente dans un hydrogel gonflé. Grâce à la digestion avec la proteinase K, les protéines structurelles sont fendillées permettant un gonflement isotropical du gel dans la dernière étape. La dialyse de l’échantillon dans l’eau entraîne une expansion de 4 à 4,5 fois de l’échantillon et l’échantillon peut être photographié au microscope à fluorescence conventionnel, ce qui rend une résolution potentielle de 70 nm.

Introduction

L’albuminurie est un paramètre de substitution du risque cardiovasculaire et résulte de la perturbation du filtre glomerular¹. Le filtre glomerular est composé de l’endothélium fenestrated, de la membrane glomerular de sous-sol et du diaphragme de fente formé par des podocytes. Les processus primaires et secondaires de pied des podocytes enveloppent autour de la paroi capillaire du glomerulum^2. La structure délicate des processus de pied est maintenue par des faisceaux corticals d’actine qui servent également d’ancres pour les protéines multiples de diaphragme de fente et d’autres protéines d’adaptateur^2. La protéine dorsale du diaphragme fendue est appelée néphrine et interagit de manière homophilique avec les molécules de néphrine des podocytes opposés. Grâce à diverses protéines adaptateurs, la néphrine est liée au cytosquelette d’actine^2,3. Les mutations dans le gène d’encodage de néphrine NPHS1 mènent au syndrome néphrotique du type^{finlandais 4.}

L’une des protéines en interaction de la néphrine est la podocine, une protéine en épingle à cheveux de la famille des stomatines³. Podocin recrute de la néphrine aux radeaux lipidiques et la relie au cytosquelette d’actine⁵. La podocine est codée par le gène NPHS2. Les mutations dans NPHS2 mènent au syndrome néphrotique stéroïde-résistant^6.

Pour visualiser et co-localisé les protéines adaptateurs de l’actine, des techniques d’immunofluorescence peuvent être utilisées. Malheureusement, la barrière de diffraction de la lumière limite la résolution des microscopes conventionnels de fluorescence à 200-350 nm^7. De nouvelles techniques de microscopie, par exemple, l’épuisement des émissions stimulées (STED)^8,la microscopie de localisation photoactivée (PALM)^9,la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM ou dSTORM) ou la microscopie de suppression de l’état au sol suivie d’un retour individuel des molécules (GSDIM)^9,10,11, permettent une résolution jusqu’à environ 10 nm. Cependant, ces techniques de super résolution nécessitent des microscopes très coûteux, du personnel bien formé et ne sont donc pas disponibles dans de nombreux laboratoires.

La microscopie d’expansion (ExM) est une technique nouvelle et simple qui permet l’imagerie par super résolution avec des microscopes conventionnels et qui est potentiellement disponible pour une grande communauté de^{recherche 12}. Dans la microscopie d’expansion de rétention de protéine (proExM), l’échantillon d’intérêt (cellules ou tissu) est fixé et souillé avec des fluorophores^13. Les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente par une petite molécule (6-((Acryloyl)amino)acide hexanoïque, succinimidyl ester, AcX) dans un hydrogel gonflé¹³. Grâce à la digestion enzymatique avec proteinase K (ProK), les protéines et les fluorophores maintiennent leur position relative dans le gel après expansion^13. Après gonflement du gel, l’échantillon se dilate jusqu’à 4,5 fois (expansion volumétrique de 90 fois) menant à une résolution latérale efficace d’environ 60-70 nm (300 nm/4.5). Les modifications de cette technique peuvent même permettre une expansion 10 fois (expansion volumétrique 1000 fois), rendant une résolution de 20-30 nm sur les microscopes conventionnels^14,15,16.

Des structures glomerular de souris et de reins humains ont été visualisées par l’intermédiaire d’ExM^17. Dans cet article, nous présentons un protocole proExM détaillé pour visualiser des images de super résolution de F-actin et de la podocine de protéine d’actine-adaptateur dans les cellules utilisant un microscope conventionnel de fluorescence.

Protocol

1. Fractionnement et ensemencement des cellules Réchauffez le milieu de l’aigle modifié (DMEM) stérile de Dulbecco, y compris le sérum fœtal de veau (FCS) à 10 %, la solution saline tamponnée de phosphate stérile (PBS) et la trypsine stérile à 37 °C. Activez le banc propre. Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant un glissement stérile de couvercle en verre (10 mm) à chaque puits à l’aide de forceps stériles. Mettez un plat de culture cellulaire de 10 cm avec des cellu…

Representative Results

Le concept et le moment de ce protocole proExM sont représentés à la figure 1. Le jour 5, les cellules transfectées sont fixées et tachées d’anticorps fluorescents ciblant la protéine d’intérêt (Figure 1A,B). Le jour 6, le traitement par AcX conduit à la formation de groupes d’amine sur toutes les protéines (y compris les fluorophores) (Figure 1A,B)<…

Discussion

La méthode présentée permet à l’investigateur de visualiser les protéines cellulaires, p. ex., la podocine, la néphrine et les composants cytosquelettiques, p. ex., la F-actine. Dans ce protocole, les cellules cos7 transfectées sont utilisées comme modèle pour étudier l’interaction des protéines de diaphragme fendue avec la F-actine. Malheureusement, les lignées cellulaires immortalisées des podocytes n’expriment pas suffisamment de quantités endogènes de protéines diaphragmes fendues<sup class="xre…

Materials

Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available