Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Summary

Pancreatite crônica (PC) é uma doença caracterizada por inflamação e fibrose do pâncreas, frequentemente associada a dor abdominal intratável. Este artigo se concentra na refinação da técnica para gerar um modelo de camundongo de CP via infusão de ducto biliar com ácido sulfônico de 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS).

Abstract

Pancreatite crônica (PC) é uma doença complexa que envolve inflamação pancreática e fibrose, atrofia glandular, dor abdominal e outros sintomas. Vários modelos de roedores foram desenvolvidos para estudar CP, dos quais o ducto biliar 2,4,6 -trinitrobenzeno modelo de infusão de ácido sulfônico (TNBS) replica as características da dor neuropática vista em CP. No entanto, a infusão de drogas de ducto biliar em camundongos é tecnicamente desafiadora. Este protocolo demonstra o procedimento de infusão tnbs do ducto biliar para a geração de um modelo de mouse CP. TNBS foi infundido no pâncreas através da ampola de Vater no duodeno. Este protocolo otimizeu o volume de medicamentos, técnicas cirúrgicas e o manuseio de drogas durante o procedimento. Os camundongos tratados com TNBS apresentaram características de CP refletidas por reduções de peso corporal e pâncreas, alterações nos comportamentos associados à dor e morfologia pancreática anormal. Com essas melhorias, a mortalidade associada à injeção de TNBS foi mínima. Este procedimento não é apenas crítico na geração de modelos de doenças pancreáticas, mas também é útil na entrega de medicamentos pancreáticos locais.

Introduction

Pancreatite crônica (PC) é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela atrofia do pâncreas, fibrose, dor abdominal e eventual perda das funções exócrina e endócrina¹. Os tratamentos médicos e cirúrgicos atuais não são curativos, mas são realizados para aliviar sintomas que são consequência da doença: dor abdominal refratária, disfunção endócrina e exócrina. Portanto, tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários². Os modelos animais fornecem uma ferramenta essencial para desenvolver uma melhor compreensão da doença e investigar possíveis terapêuticas³. Vários modelos de mouse para CP foram desenvolvidos, dos quais modelos de ceruleina e/ou álcool são comumente usados. Cerulein, um oligopeptide estimulando a secreção pancreática, tem sido mostrado para induzir reproduivelmente um modelo de CP com atrofia pancreática, fibrose, entre outros⁴. Outro modelo comum utiliza injeções seriais de L-arginina, que produz insuficiência exócrina semelhante à observada em pacientes humanos⁵. A CP também pode ser induzida por ligadura completa ou parcial do ducto pancreático, bem como hipertensão do ducto pancreático^6,7. Apesar da variedade de modelos animais disponíveis para PC, nenhum desses modelos reproduz efetivamente a dor abdominal experimentada pelos pacientes de PC⁸.

Estudos anteriores mostraram que a injeção pancreática local de 2,4,6 -trinitrobenzene ácido sulfônico (TNBS) replica a dor persistente experimentada pelos pacientes de PC^9,10,11. Os camundongos tratados com TNBS demonstraram hipersensibilidade abdominal e aumentaram os comportamentos relacionados à dor, bem como uma “hipersensibilidade generalizada” a estímulos dolorosos, fenômeno que tem sido observado em pacientes com PC¹⁰. Além de imitar com precisão a dor de CP, o modelo TNBS também replica outras características patológicas da condição humana, como fibrose, infiltração de células mononucleares e substituição de células acinar por tecido gorduroso^10,12. No entanto, a infusão de TNBS via ducto biliar é um procedimento tecnicamente desafiador em camundongos que pode causar a morte. Pelo que sabemos, não há protocolo visual para mostrar como a infusão do ducto biliar é realizada. Neste artigo, demonstramos o procedimento da infusão de dução bile de TNBS para gerar um modelo de mouse CP. Este procedimento ajudará a gerar modelos animais valiosos para o estudo de CP e outras doenças pancreáticas e pode ser usado para infundir outros materiais (por exemplo, vírus, células) no pâncreas¹³.

Protocol

Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H. Johnson Medical Center. Neste estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J entre 8 e 10 semanas de idade. Os camundongos estavam alojados sob um ciclo escuro padrão de 12 luz/12 com litbitumaccess ad libitumaccess à comida e à água. 1. Preparação da solução TNBS para injeção Prepare 10% de etanol …

Representative Results

Os procedimentos de infusão do ducto biliar foram otimizados para reduzir a mortalidade do camundongo associada a este procedimento10. O TNBS foi dado pela primeira vez em um volume total de 35 μL ou 50 μL. A injeção de TNBS em um volume de 50 μL poderia atingir todo o pâncreas e induzir um fenótipo de doença mais homogêneo(Figura 1B). Além disso, a injeção de TNBS usando seringa de insulina com agulha 31G poderia controlar melhor a velocidade de infusão…

Discussion

A infusão do ducto biliar de TNBS para induzir pancreatite crônica é tecnicamente desafiadora em camundongos, pois até 22,5% dos camundongos podem morrer dentro de 3-4 dias de infusão de medicamentos¹⁰. Aqui, este relatório refinou o procedimento com base em estudos anteriores e reduziu a mortalidade precoce do camundongo para <10%. Por exemplo, o aumento do volume de drogas (de 35 μL a 50μL) pode garantir que as drogas atinjam todo o pâncreas. O uso de uma seringa de insulina e um tamanh…

Materials

10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF