Dysreguleret tarmepitele barrierefunktion og immunrespons er kendetegnende for inflammatorisk tarmsygdom, der forbliver dårligt undersøgt på grund af mangel på fysiologiske modeller. Her beskriver vi en museintestinale loop-model, der anvender et godt vaskulært og eksteriøriseret tarmsegment til at studere slimhindegennemtrængelighed og leukocytrekruttering in vivo.
Tarmslimhinden er foret med et enkelt lag epitelceller, der danner en dynamisk barriere, der tillader paracellulær transport af næringsstoffer og vand, samtidig med at passage af luminale bakterier og eksogene stoffer forhindres. Et brud på dette lag resulterer i øget permeabilitet til luminalt indhold og rekruttering af immunceller, som begge er kendetegnende for patologiske tilstande i tarmen, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD).
Mekanismer, der regulerer epitelbarrierefunktion og transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), forstås ufuldstændigt på grund af manglen på eksperimentelle in vivo-metoder, der muliggør kvantitative analyser. Her beskriver vi en robust murine eksperimentel model, der anvender en udvendig tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. Den eksektiserede tarmsløjfe (iLoop) er fuldt vaskulær og giver fysiologiske fordele i forhold til ex vivo kammerbaserede tilgange, der almindeligvis anvendes til at studere permeabilitet og PMN-migration på tværs af epitelcellemonomerer.
Vi demonstrerer to anvendelser af denne model i detaljer: (1) kvantitativ måling af tarmgennemtrængelighed gennem påvisning af fluorescensmærket dextrans i serum efter intraluminale injektioner, (2) kvantitativ vurdering af migreret PMN over tarmepitelet i tarmen efter intraluminale indførelse af kemoattratanter. Vi demonstrerer gennemførligheden af denne model og giver resultater ved hjælp af iLoop i mus, der mangler det epiteltheliale stramme krydsrelaterede protein JAM-A sammenlignet med kontroller. JAM-A har vist sig at regulere epitel barriere funktion samt PMN TEpM under inflammatoriske reaktioner. Vores resultater ved hjælp af iLoop bekræfter tidligere undersøgelser og fremhæver vigtigheden af JAM-A i reguleringen af tarm permeabilitet og PMN TEpM in vivo under homøostase og sygdom.
ILoop-modellen giver en meget standardiseret metode til reproducerbare in vivo-undersøgelser af tarmhomøostase og betændelse og vil forbedre forståelsen af tarmbarrierefunktion og slimhindebetændelse i sygdomme som IBD betydeligt.
Tarmslimhinden omfatter et enkelt lag af columnar tarmepitele celler (IECs), underliggende lamina propria immunceller og muscularis slimhinden. Udover sin rolle i absorptionen af næringsstoffer er tarmepitelet en fysisk barriere, der beskytter kroppens indre mod lysmæssige commensale bakterier, patogener og diætantigener. Derudover koordinerer IIC’er og lamina propria immunceller immunresponset, der fremkalder enten tolerance eller respons afhængigt af konteksten og stimuli. Det er blevet rapporteret, at forstyrrelsen af epitelbarrieren kan gå forud for starten af patologisk slimhindebetændelse og bidrage til inflammatorisk tarmsygdom (IBD), der omfatter både colitis ulcerosa og Crohns sygdom1, 2,3,4,5,6,7. Personer med colitis ulcerosa udgør overdreven transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), der danner krypt abscesser, et fund, der har været forbundet med sværhedsgraden af sygdom8,9. Selv om kompromitteret epitel barriere funktion og overdreven immunrespons er kendetegnende for IBD, der er en mangel på eksperimentelle in vivo assays til at udføre kvantitative vurderinger af tarm permeabilitet og immuncelle rekruttering i tarmslimhinden.
De mest almindelige metoder til undersøgelse af tarmepitelet permeabilitet og PMN TEpM anvender ex vivo kammerbaserede metoder ved hjælp af IEC monolayers dyrket på semi-gennemtrængelige porøse membranindsatser10,11,12. Epitelbarrierens integritet overvåges enten ved målinger af transepithelial elektrisk modstand (TEER) eller fluorescein isothiocyanat (FITC) mærket dextran fra apikale til basale rum13,14,15. Tilsvarende er PMN TEpM typisk undersøgt som reaktion på en kemoattratant, der tilsættes i det nederste kammer16. PMN placeres i det øverste kammer, og efter en inkubationsperiode opsamles og kvantificeres PMN, der er migreret ind i det basale rum. Selv om disse metoder er nyttige, lette at udføre og meget reproducerbare, er de naturligvis reduktionistiske tilgange og repræsenterer ikke nødvendigvis en nøjagtig afspejling af in vivo-forholdene.
Hos mus er en almindelig analyse til undersøgelse af tarmparacellulær permeabilitet ved oral sonde af FITC-dextran og efterfølgende måling af FITC-dextran udseende i blodserummet13,17. Ulempen ved denne analyse er, at den repræsenterer en vurdering af gastrointestinale tarmkanalens overordnede barriereintegritet snarere end af regionale tarmbidrag. Derudover er Evans blå almindeligt anvendt til at evaluere vaskulær lækage in vivo18 og har også været ansat til at evaluere tarmslimhindepermeabilitet hos mus og rotte19,20,21. Kvantificeringen af Evans blå i tarmslimhinden kræver ekstraktion fra væv, der anvender inkubation i formamid natten over. Derfor kan det samme væv ikke bruges til at studere tarmepitelelengerbarhed og neutrofil infiltration.
Her fremhæver vi en simpel protokol, der reducerer antallet af dyr, der er nødvendige for at indsamle reproducerbare data om colon slimhindegennemtrængelighed og leukocyttransepithelial migration in vivo. Vi anbefaler derfor brugen af FITC-dextrans, der let kan påvises i blodserum uden at gå på kompromis med integriteten af tarmsløjfer, som kan høstes til yderligere analyse. Det skal bemærkes, at tarmlakerede sløjfer er blevet anvendt i forskellige arter (herunder mus, rotter, kaniner, kalve) til undersøgelse af bakteriel infektion (såsom Salmonella, Listeria monocytogenes og Escherichia coli)22,23,24,25 samt tarmgennemtrængelighed26; Men så vidt vi ved, er der ingen undersøgelser, der undersøger mekanismer af PMN TEpM i specifikke regioner i tarmen, såsom ileum eller tyktarm, der er almindeligt involveret i IBD.
Her beskriver vi musens tarmsløjfe (iLoop) model, der er en robust og pålidelig mikrokirurgisk in vivo-metode, der anvender et godt vaskulært og udvendigt tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. iLoop-modellen er fysiologisk relevant og gør det muligt at vurdere tarmbarrierens integritet og PMN TEpM på levende mus under anæstesi. Vi demonstrerer to anvendelser: 1) kvantificering af serumniveauer på 4 kDa FITC-dextran efter intraluminale administration i iLoop 2) kvantificering af transmigreret PMN i iLoop lumen efter intraluminale injektion af potente chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Desuden udnytter iLoop-modellen med Jam-a-nullmus eller mus, der huser selektivt tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) sammenlignet med kontrolmus er vi i stand til at bekræfte tidligere undersøgelser, der har rapporteret et stort bidrag til stramt krydsrelateret protein JAM-A til tarmgennemtrængelighed og neutrofil transmigration15,28,29,30,31.
iLoop-modellen er en yderst funktionel og fysiologisk metode, der kan bruges til at bekræfte in vitro-assays. Desuden er dette en alsidig eksperimentel model, der gør det muligt at studere forskellige reagenser, der kan injiceres i løkken lumen, herunder kemokiner, cytokiner, bakterielle patogener, toksiner, antistoffer og terapi.
De mekanismer, der er ansvarlige for dysregulering af tarmbarrierefunktion og immuncellerekruttering under patologiske tilstande som IBD, forstås ufuldstændigt. Her beskriver vi en robust in vivo murine-model, der anvender et godt vaskulært eksteriøriseret tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm og giver mulighed for vurdering af tarmgennemtrængelighed, neutrofile migrationsundersøgelser såvel som andre applikationer.
ILoop er en ikke-genopretningsoperation, der udføres på …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Sven Flemming fra Universitetet i Wuerzburg for hans bidrag til etableringen af den proksimale kolon loop model, Sean Watson for forvaltningen af musen kolonier og Chithra K. Muraleedharan for at hjælpe med erhvervelsen af billeder af iLoop model. Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfond/DFG (BO 5776/2-1) til KB, R01DK079392, R01DK072564 og R01DK061379 til C.A.P.
Equipment and Material | |||
BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
Solutions and Buffers | |||
Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Reagents | |||
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |