Elektriska och magnetiska fältenheter för stimulering av biologiska vävnader

Summary

Detta protokoll beskriver steg-för-steg-processen för att bygga både elektriska och magnetiska stimulatorer som används för att stimulera biologiska vävnader. Protokollet innehåller en riktlinje för att simulera beräknings elektriska och magnetiska fält och tillverkning av stimulatorenheter.

Abstract

Elektriska fält (EFs) och magnetfält (MFs) har använts i stor utsträckning av vävnadsteknik för att förbättra celldynamiken som spridning, migrering, differentiering, morfologi och molekylär syntes. Variabler som stimuli styrka och stimuleringstider måste dock beaktas när man stimulerar antingen celler, vävnader eller byggnadsställningar. Med tanke på att EU och MFs varierar beroende på cellulärt svar är det fortfarande oklart hur man bygger enheter som genererar adekvata biofysiska stimuli för att stimulera biologiska prover. I själva verket finns det brist på bevis för beräkningen och fördelningen när biofysiska stimuli tillämpas. Detta protokoll är inriktat på konstruktion och tillverkning av produkter för att generera EU-fonder och MFs och implementering av en beräkningsmetodik för att förutsäga biofysisk stimulifördelning inom och utanför biologiska prover. EF-enheten bestod av två parallella elektroder av rostfritt stål som ligger högst upp och längst ner i biologiska kulturer. Elektroder var anslutna till en oscillator för att generera spänningar (50, 100, 150 och 200 Vp-p) vid 60 kHz. MF-enheten bestod av en spole, som strömförseddes med en transformator för att generera en ström (1 A) och spänning (6 V) vid 60 Hz. Ett polymethylmetylmetakrylatstöd byggdes för att lokalisera de biologiska kulturerna i mitten av spolen. Beräkningssimuleringen belyses den homogena fördelningen av EU och MFs inom och utanför biologiska vävnader. Denna beräkningsmodell är ett lovande verktyg som kan ändra parametrar som spänningar, frekvenser, vävnadsmorfologier, brunnsplattatyper, elektroder och spolestorlek för att uppskatta EU och MFs för att uppnå ett cellulärt svar.

Introduction

EU och MFs har visat sig ändra celldynamiken, stimulera spridning och öka syntesen av de viktigaste molekylerna i samband med den extracellulära matrisen av^{vävnader 1}. Dessa biofysiska stimuli kan appliceras på olika sätt med hjälp av specifika inställningar och enheter. När det gäller anordningar för att generera EU-medel använder stimulatorer för direktkoppling elektroder som är i kontakt med biologiska prover in vitro eller implanteras direkt i vävnader hos patienter och djur in vivo^2. Det finns dock fortfarande begränsningar och brister som inkluderar otillräcklig biokompatibilitet av elektroderna i kontakt, förändringar i pH- och molekylära syrenivåer¹. Tvärtom genererar indirekta kopplingsanordningar EU-filer mellan två elektroder, som placeras parallellt med biologiska prover³, vilket möjliggör en icke-invasiv alternativ teknik för att stimulera biologiska prover och undvika direktkontakt mellan vävnader och elektroder. Denna typ av enhet kan extrapoleras till framtida kliniska applikationer för att utföra förfaranden med minimal invasion till patienten. När det gäller enheter som genererar MFs skapar induktiva kopplingstimulatorer en tidsvarierande elektrisk ström, som strömmar genom en spole som ligger runt^{cellkulturer 4,5}. Slutligen finns det kombinerade enheter, som använder EU och statiska MFs för att generera övergående elektromagnetiska fält¹. Med tanke på att det finns olika konfigurationer för att stimulera biologiska prover är det nödvändigt att överväga variabler som spänning och frekvens när biofysiska stimuli appliceras. Spänning är en viktig variabel, eftersom den påverkar beteendet hos biologiska vävnader; till exempel har det visat sig att cellmigration, orientering och genuttryck beror på amplituden av applicerad^{spänning 3,6,7,8,9,10}. Frekvens spelar en viktig roll i biofysisk stimulering, eftersom det har visat sig att dessa förekommer naturligt in vivo. Det har visat sig att höga och låga frekvenser har positiva effekter på celler. särskilt i cellmembranspänningsgrisade kalciumkanaler eller endoplasmiskt retikulum, som utlöser olika signalvägar på intracellulär nivå^1,7,11.

Enligt ovan består en anordning för att generera EU-fonder av en spänningsgenerator ansluten till två parallella kondensatorer¹². Denna enhet genomfördes av Armstrong et al. för att stimulera både proliferativ hastighet och molekylär syntes av kondrocyter¹³. En anpassning av denna enhet utfördes av Brighton et al. som modifierade cellkulturens brunnsplattor genom att borra sina övre och nedre lock. Hål fylldes av täckglas, där bottenglasen användes för att odla biologiska vävnader. Elektroder placerades på varje täckrutschbana för att generera EFs¹⁴. Denna enhet användes för att elektriskt stimulera kondrocyter, osteoblaster och brosk explanter, visar en ökning av cellproliferation^14,15,16 och molekylär syntes^3,17. Enheten som designades av Hartig et al. bestod av en våggenerator och en spänningsförstärkare, som var anslutna till parallella kondensatorer. Elektroder tillverkades av högkvalitativt rostfritt stål som ligger i ett isolerande fodral. Enheten användes för att stimulera osteoblaster, visar en betydande ökning av spridning och proteinsekretion¹⁸. Enheten som användes av Kim et al. bestod av ett bifasiskt strömstimulatorchip, som byggdes med hjälp av en tillverkningsprocess av kompletterande halvledare av högspänningsmetalloxid. En kultur välplåt utformades för att odla celler över en ledande yta med elektrisk stimulering. Elektroder var belagda i guld över kiselplattor¹⁹. Denna anordning användes för att stimulera osteoblaster, vilket visar en ökning av spridningen och syntesen av vaskulär endoteltillväxtfaktor¹⁹, och stimulera produktionen av alkalisk fosfatasaktivitet, kalciumdeposition och benmorfogena proteiner²⁰. På samma sätt användes denna anordning för att stimulera proliferativ hastighet och uttryck av vaskulär endotel tillväxtfaktor för mänskliga benmärg mesenchymala stamceller²¹. Enheten som designades av Nakasuji et al. bestod av en spänningsgenerator ansluten till platinaplattor. Elektroder byggdes för att mäta den elektriska potentialen vid 24 olika punkter. Denna anordning användes för att stimulera kondrocyter, vilket visar att EFs inte ändrade cellmorfologi och ökad spridning och molekylär syntes²². Den anordning som användes av Au et al. bestod av en glaskammare utrustad med två kolstavar anslutna till en hjärtstimulator med platinatrådar. Denna stimulator användes för att stimulera kardiomyocyter och fibroblaster, förbättra cellförlängning och fibroblast inriktning²³.

Olika MF-enheter har tillverkats baserat på Helmholtz spolar för att stimulera flera typer av biologiska prover. Till exempel har Helmholtz spolar använts för att stimulera spridning och molekylär syntes av kondrocyter^24,25, förbättra proteoglykansyntesen av artikulär brosk explanter²⁶, förbättra genuppreglering relaterad till benbildning av osteoblastliknande celler²⁷, och öka spridningen och molekylära uttrycket av endotelceller²⁸. Helmholtz spolar genererar MFs i två spolar som ligger framför varandra. Spolarna skall placeras med ett avstånd som motsvarar spolens radie för att säkerställa ett homogent MF. Nackdelen med att använda Helmholtz spolar ligger i spoldimensionerna, eftersom de måste vara tillräckligt stora för att generera den önskade MF-intensiteten. Dessutom måste avståndet mellan spolarna vara tillräckligt för att säkerställa en homogen fördelning av MFs runt biologiska vävnader. För att undvika problem orsakade av Helmholtz spolar har olika studier fokuserats på solenoidspolar tillverkning. Solenoidspolar är baserade på ett rör, som lindas med koppartråd för att generera MFs. Koppartrådsingångar kan anslutas direkt till uttaget eller en strömförsörjning för att driva spolen och skapa MFs i mitten av solenoiden. Ju fler varv spolen har, desto större är MF-genererad. MF-magnituden beror också på spänningen och strömmen som appliceras för att ge ström åt^{spolen 29}. Solenoidspolar har använts för att stimulera magnetiskt olika typer av celler som HeLa, HEK293 och MCF7³⁰ eller mesenkymala stamceller³¹.

Produkter som används av olika upphovsmän har inte beaktat vare sig elektrodernas tillräckliga storlek eller rätt längd på spolen för att homogent distribuera både EUF och MFs. Dessutom genererar enheter fasta spänningar och frekvenser, vilket begränsar deras användning för att stimulera specifika biologiska vävnader. Av denna anledning utförs i detta protokoll en riktlinje för beräkningssimulering för att simulera både kapacitiva system och spolar för att säkerställa homogen fördelning av EU och MFs över biologiska prover, vilket undviker kanteffekten. Dessutom visas att utformningen av elektroniska kretsar genererar spänningar och frekvens mellan elektroderna och spolen, vilket skapar EU-fonder och MFs som kommer att övervinna begränsningar som orsakas av impedans av cellkulturbrunnplattor och luft. Dessa modifieringar kommer att göra det möjligt att skapa icke-invasiva och adaptiva bioreaktorer för att stimulera någon biologisk vävnad.

Protocol

1. Simulering av EU-fonder och MFs OBS: Simulering av EU och MFs utfördes i COMSOL Multiphysics. Välj en axisymmetrisk 2D-konfiguration som representerar både domäner elektriska och magnetiska. I fysikkonfigurationen väljer du antingen gränssnittet Elektrisk ström för att beräkna EFs i parallella elektroder eller magnetic field-gränssnittet för att beräkna MFs runt spolar. I studiekonfigurationen väljer du Fre…

Representative Results

BeräkningssimuleringFördelningar av EUF och MFs visas i figur 3. Å ena sidan var det möjligt att observera den homogena fördelningen av EU-fonder i kapacitivsystemet (figur 3A). Ef ritades för att i detalj observera fältets storlek inuti det biologiska provet (figur 3B). Denna simulering var användbar för att parametrisera storleken på elektroderna och tillverka dem för att undvika kanteffekten. Å an…

Discussion

Behandlingar som används för att läka olika patologier som påverkar mänskliga vävnader är farmakologiska terapier³² eller kirurgiska^{ingrepp 33}, som försöker lindra smärta lokalt eller ersätta drabbade vävnader med explanter eller transplantationer. Nyligen har autolog cellterapi föreslagits som en alternativ terapi för att behandla skadade vävnader, där celler isoleras från patienten och utvidgas, genom in vitro-tekniker, för att implanteras på platsen f?…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1