Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l’espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.
Le proteine istono acetilate possono essere facilmente espresse in Escherichia coli che codifica per un mutante, Nε-acetil-lisina (AcK) specifico Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-sintetasi (MmAcKRS1) e il suo tRNA imparentato (tRNAPyl)per assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. MmAcKRS1 e tRNAPyl forniscono AcK in un sito di mutazione ambrata nell’mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per incorporare AcK nei siti di llysina H3. La pirrolisil-tRNA sintetasi (PylRS) può anche essere facilmente evoluta per incorporare altri amminoacidi non canonici (bcAA) per la modifica o la funzionalizzazione delle proteine specifiche del sito. Qui dettagliamo un metodo per incorporare AcK usando il sistema MmAcKRS1 nell’istono H3 e integriamo proteine H3 acetilate in mononucleosomi ricostituiti. I mononucleosomi ricostituiti acetilati possono essere utilizzati in saggi biochimici e leganti, determinazione della struttura e altro ancora. Ottenere mononucleosomi modificati è fondamentale per progettare esperimenti relativi alla scoperta di nuove interazioni e alla comprensione dell’epigenetica.
Abbiamo utilizzato PylRS e tRNAPyl per sintetizzare e assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. PylRS si è dimostrato prezioso come strumento di espansione del codice genetico per produrre proteine con modifiche post traslazionali (PTM) ed è stato geneticamente evoluto per incorporare circa 200 diverse bcAA. PylRS incorpora ad un codone di arresto ambrato, rimuovendo la concorrenza da altri amminoacidi durante la traduzione. Il PylRS è stato scoperto per la prima volta in archea metanogenica, e da allora è stato utilizzato in biologia chimica per incorporare nuovi gruppi chimici reattivi nelle proteine1,2.
MmAcKRS1 è stato evoluto da Methanosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizzato nel nostro laboratorio per la sintesi di proteine acetilate3,4,5,6. MmAcKRS1 consegna AcK in un sito di mutazione ambrata nell’mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per incorporare siti di lisina H3 di AcK, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 e K79 istono H3 per studiare l’attività di Sirtuin 1, 2, 6 e 7 sui mononucleosomi acetilati4,5,6. Qui dettagliamo questo metodo per esprimere istoni acetilati e nucleosomi acetilati ricostituiti.
È essenziale seguire questo protocollo in ogni dettaglio durante un esperimento. I nucleosomi non sono molto stabili e molti tentativi ed errori sono andati a determinare questo protocollo. È fondamentale rimuovere i precipitati ad ogni fase (o quando osservato) perché il particolato può facilmente interferire con i processi di assemblaggio. Tieni sempre i campioni di istone sul ghiaccio. Se i nucleosomi vengono conservati a 4 °C per troppo tempo, possono smontare spontaneamente. Assicurarsi di controllare eventuali…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare il Dr. Wesley Wang per aver posto le basi per questo protocollo e il suo prezioso mentoring. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da National Institutes of Health (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e Welch Foundation (Grant A-1715).
0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
100x TE Buffer | NA | NA | |
2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
Acetyllysine | |||
Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
Elution Buffer | NA | NA | |
Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
His-TEV protease | |||
Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
petDUET-His-TEV-H2A | |||
petDUET-His-TEV-H2B | |||
petDUET-His-TEV-H3 | |||
pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
Thermocycler |