Ekstracellulær glutamatutløst systemisk kalsiumsignalering er avgjørende for induksjon av planteforsvarsresponser på mekanisk såring og plantelevende angrep i planter. Denne artikkelen beskriver en metode for å visualisere den romlige og tidsmessige dynamikken i begge disse faktorene ved hjelp av Arabidopsis thaliana planter som uttrykker kalsium- og glutamatfølsomme fluorescerende biosensorer.
Planter reagerer på mekaniske påkjenninger som sår og plantelevende ved å indusere forsvarsresponser både i de skadede og i de distale uskadede delene. Ved såring av et blad oppstår en økning i cytosolisk kalsiumionkonsentrasjon (Ca2 + signal) på sårstedet. Dette signalet overføres raskt til uskadede blader, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vår nylige forskning viste at glutamat som lekker fra de sårede cellene i bladet inn i apoplasten rundt dem, fungerer som et sårsignal. Dette glutamatet aktiverer glutamatreseptorlignende Ca2+ gjennomtrengelige kanaler, noe som deretter fører til langdistanse Ca2 + signalutbredelse i hele anlegget. De romlige og tidsmessige egenskapene til disse hendelsene kan fanges opp med sanntidsavbildning av levende planter som uttrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introduserer vi en planteomfattende bildemetode i sanntid for å overvåke dynamikken i både Ca2+ -signalene og endringer i apoplastisk glutamat som oppstår som respons på sår. Denne tilnærmingen bruker et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter som uttrykker Green Fluorescent Protein (GFP)-baserte Ca2+ og glutamatbiosensorer. I tillegg presenterer vi metodikk for enkelt å fremkalle sårindusert, glutamatutløst rask og langdistanse Ca2+ signalutbredelse. Denne protokollen kan også brukes på studier på andre plantespenninger for å bidra til å undersøke hvordan plantesystemisk signalering kan være involvert i deres signal- og responsnettverk.
Planter kan ikke unnslippe biotiske påkjenninger, for eksempel insekter som fôrer på dem, så de har utviklet sofistikerte stresssensor- og signaltransduksjonssystemer for å oppdage og deretter beskytte seg mot utfordringer som plantelevende1. Ved sår eller plantelevende angrep starter planter raske forsvarsresponser, inkludert opphopning av fytohormonet jasmonsyre (JA) ikke bare på det sårede stedet, men også i uskadede distale organer2. Denne JA utløser deretter begge forsvarsresponser i det direkte skadede vevet og induserer fortrinnsrett forsvar i de uskadede delene av anlegget. I Arabidopsisble akkumuleringen av JA indusert av sår oppdaget i distale, intakte blader innen bare noen få minutter etter skade andre steder i anlegget, noe som tyder på at et raskt og langdistansesignal overføres fra det sårede bladet3. Flere kandidater, som Ca2+, reaktive oksygenarter (ROS) og elektriske signaler, har blitt foreslått å tjene som disse langdistanse sårsignalene i anlegg4,5.
Ca2+ er et av de mest allsidige og allestedsnærværende andre messenger-elementene i eukaryote organismer. I planter forårsaker larve tygge og mekanisk såring drastiske økninger i cytosoliske Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +]cyt) både i det sårede bladet og i viklet fjerne blader6,7. Dette systemiske Ca2+ -signalet mottas av intracellulære Ca2+-sensing proteiner, noe som fører til aktivering av nedstrøms forsvarssignalveier, inkludert JA biosyntese8,9. Til tross for mange slike rapporter som støtter viktigheten av Ca2 + -signaler i plantesårresponser, er informasjon om de romlige og tidsmessige egenskapene til Ca2 + -signaler forårsaket av sår begrenset.
Sanntidsavbildning ved hjelp av genetisk kodede Ca2+-indikatorer er et kraftig verktøy for å overvåke og kvantifisere romlig og tidsmessig dynamikk i Ca2+-signaler. Til dags dato er det utviklet versjoner av slike sensorer som muliggjør visualisering av Ca2 + -signaler på nivået av en enkelt celle, til vev, organer og til og med hele planter10. Den første genetisk kodede biosensoren for Ca2 + brukt i planter var bioluminescent protein aequorin avledet fra maneter Aequorea victoria11. Selv om dette chemiluminescent proteinet har blitt brukt til å oppdage Ca2 + endringer som svar på ulike belastninger i planter12,13,14,15,16,17,18, er det ikke godt egnet for sanntidsavbildning på grunn av det ekstremt lave luminescerende signalet det produserer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserte Ca2+ indikatorer, for eksempel de gule kamelonene, har også blitt brukt til å undersøke dynamikken i en rekke Ca2+ signalhendelser i anlegg19,20,21,22,23,24. Disse sensorene er kompatible med bildemetoder og består oftest av Ca2+ bindende protein calmodulin (CaM) og et CaM-bindende peptid (M13) fra en myosinlyskjedekinase, alle smeltet sammen mellom to fluoroforproteiner, vanligvis et cyan fluorescerende protein (CFP) og en Gul fluorescerende proteinvariant (YFP)10. Ca2+ binding til CaM fremmer samspillet mellom CaM og M13 som fører til en konformasjonsendring av sensoren. Denne endringen fremmer energioverføring mellom CFP og YFP, noe som øker fluorescensintensiteten til YFP samtidig som fluorescensutslippet reduseres fra CFP. Overvåking av dette skiftet fra CFP til YFP fluorescens gir deretter et mål på økningen i Ca2 + nivå. I tillegg til disse FRET-sensorene er enkelt fluorescerende protein (FP)-baserte Ca2+ biosensorer, som GCaMP og R-GECO, også kompatible med planteavbildningsmetoder og er mye brukt til å studere [Ca2 +]cytendringer på grunn av deres høye følsomhet og brukervennlighet25,26,27,28,29,30. GCaMPs inneholder en enkelt sirkulær permutert (cp) GFP, igjen smeltet sammen til CaM og M13 peptid. Ca2+-avhengig interaksjon mellom CaM og M13 forårsaker en konformasjonsendring i sensoren som fremmer et skifte i protonasjonstilstanden til cpGFP, noe som forbedrer fluorescerende signal. Dermed, når Ca2 + nivåer stiger, øker cpGFP-signalet.
For å undersøke dynamikken i Ca2 + -signaler generert som svar på mekanisk såring eller plantelevende fôring, har vi brukt transgene Arabidopsis thaliana-planter som uttrykker en GCaMP-variant, GCaMP3 og et bredfelts fluorescensmikroskop6. Denne tilnærmingen har lyktes i å visualisere rask overføring av et langdistanse Ca2 + -signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Dermed ble en økning i [Ca2 +]cyt umiddelbart oppdaget på sårstedet, men dette Ca2 + -signalet ble deretter forplantet til nabobladene gjennom vaskulaturen innen få minutter etter sår. Videre fant vi ut at overføringen av dette raske systemiske sårsignalet avskaffes i Arabidopsis planter med mutasjoner i to glutamatreseptorlignende gener, Glutamatreseptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.66. GLR-ene ser ut til å fungere som aminosyre inngjerdede Ca2 + kanaler involvert i forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert sårrespons3, pollenrørvekst31, rotutvikling32, kaldrespons33og medfødt immunitet34. Til tross for denne godt forståtte, brede fysiologiske funksjonen til GLRs, er informasjon om deres funksjonelle egenskaper, for eksempel deres ligand spesifisitet, ion selectivity og subcellulær lokalisering, begrenset35. Nyere studier rapporterte imidlertid at GLR3.3 og GLR3.6 er lokalisert i henholdsvis phloem og xylem. PlanteglRs har likheter med ionotrope glutamatreseptorer (iGluRs)36 hos pattedyr, som aktiveres av aminosyrer, som glutamat, glycin og D-serin i pattedyrnervesystemet37. Faktisk viste vi at anvendelsen av 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet induserer et raskt, langdistanse Ca2 + signal i Arabidopsis, noe som indikerer at ekstracellulær glutamat sannsynligvis fungerer som et sårsignal i planter6. Dette svaret er avskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant som antyder at glutamat kan virke gjennom en eller begge disse reseptorlignende kanalene, og faktisk ble AtGLR3.6 nylig vist seg å være inngjerdet av disse nivåene av glutamat38.
I planter, i tillegg til sin rolle som en strukturell aminosyre, har glutamat også blitt foreslått som en viktig utviklingsregulator39; Imidlertid er dens romlige og tidsmessige dynamikk dårlig forstått. Akkurat som for Ca2 +, flere genetisk kodede indikatorer for glutamat er utviklet for å overvåke dynamikken i denne aminosyren i levende celler40,41. iGluSnFR er en GFP-basert enkelt-FP glutamat biosensor sammensatt av cpGFP og et glutamatbindingsprotein (GltI) fra Escherichia coli42,43. Konformasjonsendringen av iGluSnFR, som induseres av glutamatbinding til GltI, resulterer i et forbedret GFP-fluorescensutslipp. For å undersøke om ekstracellulært glutamat fungerer som et signalmolekyl i plantesårrespons, koblet vi iGluSnFR-sekvensen med den grunnleggende chitinase signalpeptidsekresjonssekvensen (CHIB-iGluSnFR) for å lokalisere denne biosensoren i det apoplastiske rommet6. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å avbilde eventuelle endringer i den apoplastiske glutamatkonsentrasjonen ([Glu]apo) ved hjelp av transgene Arabidopsis-planter som uttrykker denne sensoren. Vi oppdaget raske økninger i iGluSnFR-signalet på sårstedet. Disse dataene støtter ideen om at glutamat lekker ut av de skadede cellene / vevene til apoplasten ved såring og fungerer som et skadesignal som aktiverer GLR-ene og fører til langdistanse Ca2 + -signalet i plante6.
Her beskriver vi en planteomfattende sanntidsavbildningsmetode ved hjelp av genetisk kodede biosensorer for å overvåke og analysere dynamikken i langdistanse Ca2 + og ekstracellulære glutamatsignaler som svar påsåring 6. Tilgjengeligheten av bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter som uttrykker genetisk kodede biosensorer gir en kraftig, men likevel lett implementert tilnærming for å oppdage raskt overførte langdistansesignaler, for eksempel Ca2 + bølger.
Systemisk signalering er viktig for planter å reagere på lokaliserte eksterne miljøstimuli og deretter opprettholde sin homeostase på et helt plantenivå. Selv om de ikke er utstyrt med et avansert nervesystem som dyr, bruker de rask kommunikasjon både i og mellom organer basert på faktorer som mobile elektriske (og muligens hydrauliske) signaler og forplantningsbølger av ROS og Ca2 + 46,47. Protokollen beskrevet ovenfor tillater planteomfatten…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 og 18H05491) til MT, National Science Foundation (IOS1557899 og MCB2016177) og National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G og 80NSSC19K0126) til SG.
Arabidopsis expressing GCaMP3 | Saitama University | ||
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR | Saitama University | ||
GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | ||
L-Glutamate | FUJIFILM Wako | 072-00501 | Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH]. |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | ||
Murashige and Skoog (MS) medium | FUJIFILM Wako | 392-00591 | composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH. |
Nikon SMZ25 stereomicroscope | Nikon | ||
NIS-Elements AR analysis | Nikon | ||
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) | Nikon | ||
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Square plastic Petri dish | Simport | D210-16 |