Бесконтактная модель кокультуры для изучения активации врожденных иммунных клеток во время респираторной вирусной инфекции
Summary
Этот протокол подробно описывает исследование ранних взаимодействий между вирусно инфицированными эпителиальными клетками носа и активацией врожденных клеток. Отдельные подмножества иммунных клеток можно выделить на основе их активации в ответ на вирусные инфекции. Затем они могут быть дополнительно исследованы, чтобы определить их влияние на ранние противовирусные реакции.
Abstract
Ранние взаимодействия между эпителиальным слоем носа и врожденными иммунными клетками во время вирусных инфекций остаются недостаточно изученной областью. Значение передачи сигналов врожденного иммунитета при вирусных инфекциях значительно возросло, поскольку пациенты с респираторными инфекциями, которые демонстрируют высокую врожденную активацию Т-клеток, показывают лучший исход заболевания. Следовательно, препарирование этих ранних врожденных иммунных взаимодействий позволяет прояснить процессы, которые ими управляют, и может способствовать разработке потенциальных терапевтических целей и стратегий для ослабления или даже предотвращения раннего прогрессирования вирусных инфекций. Этот протокол детализирует универсальную модель, которая может быть использована для изучения ранних перекрестных помех, взаимодействий и активации врожденных иммунных клеток из факторов, секретируемых вирусно инфицированными эпителиальными клетками дыхательных путей. Используя вирус гриппа H3N2 (A/Aichi/2/1968) в качестве репрезентативной модели вируса, врожденная клеточная активация совместно культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) была проанализирована с использованием проточной цитометрии для исследования подмножеств клеток, которые активируются растворимыми факторами, высвобождаемыми из эпителия в ответ на вирусную инфекцию. Результаты демонстрируют стратегию дифференциации подмножеств клеток и выявляют четкие различия между активированными популяциями PBMCs и их перекрестными помехами с контрольным и инфицированным эпителием. Затем активированные подмножества могут быть дополнительно проанализированы для определения их функций, а также молекулярных изменений, специфичных для клеток. Результаты такого перекрестного исследования могут выявить факторы, которые важны для активации жизненно важных врожденных клеточных популяций, которые полезны для контроля и подавления прогрессирования вирусной инфекции. Кроме того, эти факторы могут быть повсеместно применены к различным вирусным заболеваниям, особенно к вновь возникающим вирусам, чтобы ослабить воздействие таких вирусов, когда они впервые циркулируют в наивных человеческих популяциях.
Introduction
Респираторные вирусы, пожалуй, являются одними из наиболее распространенных патогенов, вызывающих серьезное медицинское и экономическое бремя. От периодических глобальных вспышек новых эпидемических штаммов (например, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) до сезонных штаммов гриппа каждый год, вирусы представляют постоянную угрозу для здоровья населения. Хотя вакцины составляют основную часть ответных мер на эти глобальные проблемы общественного здравоохранения, отрезвляюще отметить, что эти контрмеры являются просто ответными 1,2. Кроме того, задержка между появлением нового инфекционного штамма и успешной разработкой его вакцины неизбежна3, что приводит к периоду, когда меры, доступные для сдерживания распространения вируса, сильно ограничены.
Эти задержки еще более подчеркиваются издержками, которые наносятся обществу как в экономическом, так и в социальном плане. Только сезонный грипп несет ответственность за примерно 8 миллиардов долларов косвенных расходов, 3,2 миллиарда долларов медицинских расходов и 36,3 тысячи смертей в Соединенных Штатах Америки ежегодно4. Это до рассмотрения расходов на исследования, которые необходимы для финансирования разработки вакцины. Эпидемические вспышки имеют еще более серьезные последствия для общества, усугубляемые растущими темпами глобализации с каждым годом, о чем свидетельствуют глобальные сбои, вызванные возникновением и быстрым распространением тяжелого острого респираторного синдрома короновируса 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Недавние исследования показали, что инфицированные пациенты, имеющие большую популяцию активированных врожденных Т-клеток, как правило, имеют лучший исход заболевания 8,9,10. Кроме того, врожденная популяция Т-клеток подразделяется на несколько подгрупп: слизисто-ассоциированные инвариантные Т-клетки (MAIT), Vδ1 γδ Т-клетки, Vδ2 γδ Т-клетки и естественные Т-киллеры (NKT). Эти подгруппы врожденных Т-клеток также демонстрируют гетерогенность в своих популяциях, увеличивая сложность взаимодействий между клеточными популяциями, участвующими во врожденном иммунном ответе11. Следовательно, механизм, который активирует эти врожденные Т-клетки и знание конкретных подгрупп врожденных Т-клеток, может обеспечить другое направление исследований для ограничения инфекционного воздействия этих вирусов на человека-хозяина, особенно в период разработки вакцины.
Эпителиальные клетки, инфицированные гриппом, продуцируют факторы, которые быстро активируют врожденные Т-клетки 12,13,14. Основываясь на этом открытии, эта бесконтактная модель кокультуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) направлена на имитацию ранних химических взаимодействий (опосредованных растворимыми факторами, высвобождаемыми инфицированным эпителиальным слоем) между инфицированным носовым эпителиальным слоем и НБМК во время ранней инфекции. Физическое разделение между носовым эпителиальным слоем (культивируемым на мембранных вставках) и PBMCs (в камере внизу) и целостность эпителия предотвращают прямую инфекцию PBMCs вирусом, что позволяет детально изучить влияние эпителиальных растворимых факторов на PBMCs. Поэтому выявленные факторы могут быть дополнительно исследованы на предмет их терапевтического потенциала в индуцировании соответствующей врожденной популяции Т-клеток, которая может защитить от инфекции гриппа. Поэтому в этой статье подробно описаны методы создания кокультуры для изучения врожденной активации Т-клеток из растворимых факторов, полученных из эпителия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Врожденные иммунные реакции против вирусов являются недостаточно изученной областью исследований в области противовирусного лечения. Эпителиальные клетки дыхательных путей и врожденные иммунные клетки работают согласованно, чтобы подавить репликацию вируса во время инфекции, поми…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить научных сотрудников кафедры отоларингологии NUS и кафедры микробиологии и иммунологии за их помощь в работе, связанной с культурой hNEC и вирусной культурой. Мы также хотели бы поблагодарить хирургов и хирургическую бригаду в Национальной университетской больнице, отделение отоларингологии, за их помощь в предоставлении образцов клеток и крови, необходимых для исследования.
Это исследование финансировалось Национальным советом по медицинским исследованиям, Сингапур No. NMRC/CIRG/1458/2016 (Де Юн Вану) и MOH-OFYIRG19may-0007 (Кай Сен Тану). Кай Сен Тан является получателем стипендиальной поддержки от Европейской исследовательской стипендии по аллергии и клинической иммунологии (EAACI) 2019 года.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
Referências
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
