Målet med denne protokollen er å beskrive generering og volumetrisk analyse av vaskulære menneskelige hudekvivalenter ved hjelp av tilgjengelige og enkle teknikker for langsiktig kultur. I den grad det er mulig, beskrives begrunnelsen for tiltak for å gi forskere muligheten til å tilpasse seg basert på deres forskningsbehov.
Humane hudekvivalenter (HSE) er vevskonstruerte konstruksjoner som modellerer epidermale og dermale komponenter i menneskelig hud. Disse modellene har blitt brukt til å studere hudutvikling, sårheling og podningsteknikker. Mange HMS-er mangler fortsatt vaskulatur og analyseres i tillegg gjennom postkultur histologisk seksjonering som begrenser volumetrisk vurdering av strukturen. Presentert her er en enkel protokoll som bruker tilgjengelige materialer for å generere vaskulære menneskelige hudekvivalenter (VHSE); videre beskrevet er volumetriske avbildnings- og kvantifiseringsteknikker for disse konstruksjonene. Kort sagt er VHSE konstruert i 12 brønnkulturinnlegg der dermale og epidermale celler blir sådd i rottehale kollagen type I gel. Dermalrommet består av fibroblast og endotelceller spredt gjennom kollagengel. Epidermalrommet består av keratinocytter (hudepiteleceller) som skiller seg ut ved luftvæskegrensesnittet. Det er viktig at disse metodene kan tilpasses basert på forskerens behov, med resultater som viser VHSE-generering med to forskjellige fibroblastcelletyper: humane dermale fibroblaster (hDF) og humane lungefibroblaster (IMR90s). VHSE ble utviklet, avbildet gjennom konfektmikroskopi, og ble analysert ved hjelp av beregningsprogramvare ved 4- og 8-ukers tidspunkter. En optimalisert prosess for å fikse, flekke, bilde og klare VHSEer for volumetrisk undersøkelse er beskrevet. Denne omfattende modellen, avbildningen og analyseteknikkene kan enkelt tilpasses de spesifikke forskningsbehovene til individuelle laboratorier med eller uten tidligere HMS-erfaring.
Menneskelig hud utfører mange viktige biologiske funksjoner, inkludert å fungere som en immun / mekanisk barriere, regulere kroppstemperatur, delta i vannretensjon og sensoriske roller1,2,3,4. Anatomisk er huden det største organet i menneskekroppen og består av tre hovedlag (epidermis, dermis og hypodermis) og har et komplekst system av stromale, vaskulære, kjertel- og immun/nervesystemkomponenter i tillegg til epidermale celler. Epidermis i seg selv består av fire lag med celler som kontinuerlig fornyes for å opprettholde barrierefunksjon og andre strukturer av innfødt hud (dvs. svette og talgkjertler,negler) 3. Hudfysiologi er viktig i immunfunksjon, sårheling, kreftbiologi og andre felt, noe som fører til at forskere bruker et bredt spekter av modeller, fra in vitro monokulturer til in vivo dyremodeller. Dyremodeller tilbyr evnen til å studere den fulle kompleksiteten i hudfysiologi, men ofte brukte dyremodeller som mus har betydelige fysiologiske forskjeller sammenlignet med mennesker5. Disse begrensningene, og den økte kostnaden for dyremodeller, har fått mange forskere til å fokusere på å utvikle in vitro-modeller som nærmere gjenspeiler fysiologien til menneskelig hud1,6. Av disse er en av de enklere modelltypene den menneskelige epidermale ekvivalenten (HEE; også referert til som halvtykkelses hudmodeller) som bare består av epidermale keratinocytter på encellulær dermal matrise, men fanger epidermal differensiering og stratifisering sett in vivo. Basert på dette blir modeller som inneholder dermale og epidermale komponenter (keratinocytter og fibroblaster) ofte referert til som menneskelige hudekvivalenter (HMS), hudmodeller med full tykkelse eller organotypiske hudkonstruksjoner (OSC). Kort sagt, disse modellene genereres ved å innkapsle dermale celler i gelmatriser og så epidermale celler på toppen. Epidermal differensiering og stratifisering kan deretter oppnås via spesialiserte medier og lufteksponering7. Hudekvivalenter har oftest blitt generert gjennom selvmonteringsteknikker ved hjelp av dermale geler laget av kollagen type I (enten av rottehale eller bovin hudopprinnelse)1,8, men lignende modeller har innlemmet andre matrisekomponenter som fibrin9,10, fibroblast avledet11,12, kadaveriske de-epidermiserte membraner13,14,15,16, kommersielt tilgjengelige geler og andre1,12,13,17,18,19. For tiden er det hudekvivalenter kommersielt tilgjengelig (som tidligere gjennomgått1,2). Disse er imidlertid først og fremst utviklet for terapeutiske formål og kan ikke tilpasses lett til spesifikke forskningsspørsmål.
HSE er brukt i studier av sårheling, podning, toksikologi og hudsykdom/utvikling11,12,13,16,8,20,21,22,23. Selv om 3D-kultur mer omfattende modellerer funksjoner av menneskelig vev sammenlignet med 2D-kulturer24, muliggjør inkludering av forskjellige celletyper som mer nøyaktig gjenspeiler in vivo-populasjonen studier av cellecellekoordinering i komplekse vev24,25,26. De fleste HSEer inkluderer bare dermale fibroblaster og epidermale keratinocytter27, selv om in vivo-hudmiljøet inneholder mange andre celletyper. Nyere studier har begynt å inkludere flere cellepopulasjoner; disse inkluderer endotelceller i vaskulatur10,28,29,30,31,32,33,34, adipocytter i sub-kutan vev35,36, nervekomponenter19,21, stamceller27,37,38, immunceller10,39,40,41,42og andre sykdoms-/kreftspesifikke modeller16,40,43,44,45,46,47. Spesielt viktig blant disse er vaskulatur; mens noen HSEer inkluderer vaskulære celler, totalt sett mangler de fortsatt omfattende kapillære elementer med tilkobling over hele dermis10,29 , utvidet in vitro stabilitet28, og passende kartetthet. Videre vurderes HMS-modeller vanligvis gjennom postkulturelle histologiske seksjonering som begrenser analysen av HSEs tredimensjonale struktur. Tredimensjonal analyse muliggjør volumetrisk vurdering av vaskulær tetthet48,49 samt regional variasjon av epidermal tykkelse og differensiering.
Selv om HMS-er er en av de vanligste organotypiske modellene, er det mange tekniske utfordringer med å generere disse konstruksjonene, inkludert identifisering av passende ekstracellulær matrise og celletetthet, medieoppskrifter, riktige luftvæskegrensesnittprosedyrer og postkulturanalyse. Videre, mens HEE- og HMS-modeller har publisert protokoller, eksisterer ikke en detaljert protokoll som omfatter dermal vaskulatur og volumetrisk avbildning i stedet for histologisk analyse. Dette arbeidet presenterer en tilgjengelig protokoll for kulturen av vaskulære menneskelige hudekvivalenter (VHSE) fra hovedsakelig kommersielle cellelinjer. Denne protokollen er skrevet for å være lett tilpassbar, noe som muliggjør rett frem tilpasning til forskjellige celletyper og forskningsbehov. Av hensyn til tilgjengelighet, tilgjengelighet og kostnader ble bruk av enkle produkter og generasjonsteknikker prioritert fremfor bruk av kommersielt tilgjengelige produkter. Videre beskrives enkle volumetriske avbildnings- og kvantifiseringsmetoder som gjør det mulig å vurdere VHSEs tredimensjonale struktur. Ved å oversette denne prosedyren til en robust og tilgjengelig protokoll kan ikke-spesialiserte forskere anvende disse viktige modellene i persontilpasset medisin, vaskulær vevsteknikk, graftutvikling og legemiddelevaluering.
Denne protokollen har vist en enkel og repeterbar metode for generering av VHSEer og deres tredimensjonale analyse. Det er viktig at denne metoden er avhengig av få spesialiserte teknikker eller utstyrsdeler, noe som gjør den tilgjengelig for en rekke laboratorier. Videre kan celletyper erstattes med begrensede endringer i protokollen, slik at forskere kan tilpasse denne protokollen til deres spesifikke behov.
Riktig kollagen gelering er et utfordrende skritt i å etablere hudkultur. Spesielt når du bruker rå preparater uten rensing, kan sporforurensninger påvirke gelasjonsprosessen. For å sikre konsistens bør grupper av eksperimenter utføres med samme kollagenbestand som skal brukes til VHSE-generering. Videre bør gelasjonen ideelt sett forekomme ved en pH på 7-7,4, og sporforurensninger kan skifte pH. Før du bruker kollagenlagenlagen, bør det gjøres en øvelse acellulær gel ved ønsket konsentrasjon og pH bør måles før gelering. Å fullføre denne kollagenkvalitetskontrollen før du begynner dermal komponentsåing, vil identifisere problemene med riktig gelering og kollagen homogenitet før du setter opp et komplett eksperiment. I stedet for å så etcellulært kollagen direkte på en kulturinnsats, kan du frø litt kollagen på en pH-stripe som evaluerer hele pH-skalaen og verifiserer en pH på 7-7,4. Gelering kan evalueres ved å bruke en dråpe av kollagengelløsningen på en deksler eller vevskultur plastbrønnplate (en brønnplate anbefales å simulere de begrensede sidene av en kulturinnsats). Etter gelasjonstid skal kollagenet være solid, det vil si at det ikke skal strømme når platen er vippet. Under fasekontrastmikroskopi skal kollagenet se homogent og klart ut. Sporadiske bobler fra kollagen såing er normale, men store amorfe blober av ugjennomsiktig kollagen i den klare gelen indikerer et problem-sannsynlig på grunn av utilstrekkelig blanding, feil pH, og / eller unnlatelse av å holde kollagenet avkjølt under blanding.
Cellesåingsmengdene og -mediet kan justeres. I protokollen ovenfor er de innkapslede cellemengdene optimalisert for en 12-brønns innsats ved 7,5 x 104 fibroblaster og 7,5 x 105 endotelceller per ml kollagen med 1,7 x 105 keratinocytter frøet på toppen av den dermale konstruksjonen. Celletetthet er optimalisert for denne VHSE-protokollen basert på de foreløpige studiene og den forrige forskningen som undersøkte 3D vaskulær nettverksgenerering i ulike kollagenkonsentrasjoner48 og HMS generasjon22,80,81. I lignende systemer er de publiserte endotelcelletetthetene 1,0 x 106 celler / ml kollagen48; fibroblastkonsentrasjonene varierer ofte fra 0,4 x 105 celler/ml kollagen22,28,82 til 1 x 105 celler/ml kollagen8,58,83,84,85; og keratinocyttkonsentrasjonene varierer fra 0,5 x 105 [celler/cm2]80 til 1 x 105 [celler/cm2]8. Celletetthet kan optimaliseres for spesifikke celler og forskningsspørsmål. Tredimensjonale kulturer med kontraktile celler, for eksempel fibroblaster, kan trekke seg sammen, noe som fører til levedyktighetsreduksjon og kulturtap86,87. Foreløpige eksperimenter bør fullføres for å teste sammentrekning av dermalrommet (som kan oppstå med flere dermale celler, mer sammentrekningsceller, lengre nedsenkningskulturer eller mykere matriser) og for å teste epidermal overflatedekning. I tillegg kan antall dager i nedsenking og hastigheten på avsmalning av seruminnholdet også tilpasses hvis overdreven dermal sammentrekning oppstår eller en annen grad av keratinocyttdekning er nødvendig. For eksempel, hvis sammentrekning blir lagt merke til i løpet av perioden med dermal nedsenking eller mens keratinocytter etablerer en overflatemonolayer, beveger seg raskere gjennom serumavsmalningsprosessen og hever VHSE til ALI kan bidra til å forhindre ytterligere sammentrekning. På samme måte, hvis keratinocyttdekning ikke er ideell, kan endring av antall dager som VHSE er nedsenket uten serum bidra til å øke den epidermale monolayerdekningen og redusere sammentrekningen siden serumet er utelatt. Endringer i celletetthet eller andre forslag ovenfor må optimaliseres for de spesifikke kulturene og forskningsmålene.
For å etablere en riktig stratifisering av epidermis under luftvæskegrensesnittperioden (ALI), er det viktig å regelmessig sjekke og opprettholde væskenivåer i hver brønn slik at ALI og passende hydrering av hver konstruksjon holdes gjennom kulturlengden. Medienivåer bør kontrolleres og spores daglig til konsistente ALI-nivåer er etablert. Det epidermale laget skal se hydrert ut, ikke tørt, men det bør ikke være mediebassenger på konstruksjonen. Under ALI vil konstruksjonen utvikle en ugjennomsiktig hvit / gul farge som er normal. Det epidermale laget vil sannsynligvis utvikle seg ujevnt. Vanligvis vippes VHSEene på grunn av kollagen såing eller dermal sammentrekning. Det er også normalt å observere en høyere epidermal del midt i konstruksjonen i mindre konstruksjoner (24 brønnstørrelse) og en åsformasjon rundt omkretsen av VHSE i 12 brønnstørrelser. Sammentrekning av konstruksjonene13 kan endre disse topografiske formasjonene, og/eller kan ikke observeres i det hele tatt.
Farging og avbildning av VHSEer introduserer mekanisk manipulasjon til VHSEene. Det er svært viktig å planlegge og begrense manipulering av hver kultur. Når manipulering er nødvendig, må du opprettholde skånsomme bevegelser når du fjerner VHSEer fra innsatsmembranene, når du tilsetter farge- eller vaskeløsninger på konstruksjonsoverflaten, og når du fjerner og erstatter VHSEer i lagrings-/bildebrønnene under bildebehandlingsforberedelse. Spesielt kan de apikale lagene i den epidermale komponenten være skjøre og er i fare for å sloughing av basale epidermale lag. Apikale lag av epidermis er skjøre og går gjennom desquamation selv i innfødt vev4, men for nøyaktig analyse av epidermal struktur er det viktig å minimere skade eller tap. Hvis epidermale lag løfter av konstruksjonen, kan de avbildes separat. De basale lagene i epidermis er mest sannsynlig fortsatt festet til dermis mens deler av de apikale lagene kan løsne. For visualisering av epidermis er en kjernefysisk flekk nyttig for å observere dette siden tette kjerner er karakteristiske for nedre og midtre lag av epidermis.
Konfokal avbildning av VHSE-etterfikseringen er diskutert i protokollen, men det er også mulig å avbilde VHSEene i hele kulturen via oppreist basert optisk koherenstomografi (OCT)88,89,90,91,92,93. VHSE er stabil nok til å tåle avbildning uten inkubasjon eller fukting i minst to timer uten merkbare effekter. Siden OCT er etikettfri og ikke-invasiv, er det mulig å spore epidermal tykkelse under modning. Andre ikke-invaderende avbildningsmodaliteter kan sannsynligvis også brukes.
Volumetrisk avbildning av de kombinerte dermale og epidermale strukturene kan være utfordrende på grunn av laserdemping dypere i VHSE. Dette kan reduseres ved å forestille konstruksjonen i to retninger, fra den epidermale siden (figur 1) og fra den dermale siden (figur 2), noe som gir god oppløsning av dermale vaskulære strukturer og epidermis. I tillegg kan prøven fjernes, noe som gir volumetriske bilder av hele strukturen med minimal demping. Flere clearingmetoder ble forsøkt, men den beskrevne metanol/metylsylatmetoden ga de beste resultatene. Forskere som er interessert i å optimalisere andre clearingmetoder, er rettet mot disse vurderingene49,61,62. Ved tømming foreslås det å ta bildet av prøven helt før fjerning, da metoden kan skade fluoroforene og / eller strukturen. Videre bør bildet fullføres så snart som mulig etter rydding, da fluorescensen kan falme i løpet av dager.
For enkelhets skyld og tilgjengelighet benyttet denne protokollen de enkleste medieblandingene som finnes i tidligere litteratur11,80. Selv om det er mange fordeler med å bruke enkle medieblandinger, gjenkjennes også begrensningene i dette valget. Andre grupper har studert effekten av spesifikke mediekomponenter på epidermal og dermal helse og funnet ut at andre medietilsetninger94, for eksempel eksterne frie fettsyrer / lipider, forbedrer epidermis stratum corneum og forbedrer hudbarrierefunksjonen. Selv om våre immunfluorescerende markører viser passende differensiering og stratifisering i epidermis, avhengig av studiene som utføres, kan det være nødvendig med ytterligere medieoptimalisering. Videre ble det ikke utført en omfattende analyse av epidermal BM ved evaluering av VHSEene som presenteres her. Integriteten til BM er en viktig indikasjon på hudekvivalenter; ulike grupper har forsket på kulturens varighet og dens effekt på BM-markeringer95 samt analyse av fibroblast tilstedeværelse og lagt vekstfaktoreffekter på BM uttrykk14. Det er viktig å merke seg at analyse av BM-komponenten bør evalueres og optimaliseres når du bruker denne protokollen.
I denne protokollen er beskrevet en prosedyre for VHSE generasjon, demonstrere resultater etter 8 uker på ALI. VHSE-kulturer har blitt dyrket opptil 12 uker hos ALI uten merkbar endring eller tap av levedyktighet, og det er mulig at de kan være levedyktige lenger. Viktigst, denne protokollen er lett tilpasningsdyktig til vanlige tilgjengelige celletyper, som demonstrert ved utskifting av dermale fibroblaster med IMR90 lungefibroblaster. Avhengig av forskerens behov og tilgjengelige ressurser, kan celletypene og medieblandingene på kulturen justeres, selv om mer forskjellige celletyper kan kreve medieoptimalisering. Oppsummert er disse prosedyrene ment å gi klarhet i kulturen til VHSEer for studiet av hudbiologi og sykdom. For å maksimere tilgjengeligheten ble protokollen utviklet denne enkle og robuste ved hjelp av vanlig utstyr, cellelinjer og reagenser som en minimal effektiv tilnærming som ytterligere kan tilpasses de spesifikke behovene til forskningsstudier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Jim Rheinwald59 og Dr. Ellen H. van den Bogaard20 for deres sjenerøse gave av N / TERT cellelinjer. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (19IPLOI34760636).
1 N NaOH | Fisher Chemical | S318-100 | (Dilute from Lab stock) |
4% Paraformaldehyde | ACROS Organics | #41678-5000, Lot # B0143461 | Made up using solid Paraformaldehyde in PBS, pH adjusted to 6.9 |
Autoclaved forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
CaCl2 | Fisher bioreagents | Cat # BP510-250, Lot # 190231 | Rnase, Dnase, Protease-Free |
Cell line, Endothelial: Microvascular Endothelial Cell (HMEC1) | ATCC | CRL-3243 | SV40 Immortalized microvascular endothelial cell. Note that 750,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Fibroblasts: dermal Human fibroblast, adult | ATCC | PCS-201-012 | Primary dermal cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Fibroblasts: human lung firbroblast (IMR90) | ATCC | CCL-186 | Primary embryonic cells. Note that 75,000 cells/mL of collagen were used. |
Cell line, Keratinocyte: N/TERT-1 | Immortalized via hTERT expression. N/TERT-1 was made using a retroviral vector conferring hygromycin resistance. Cell line established by Dickson et al. 2000. Can be replaced with ATCC PCS-200-010 or PCS-200-011. Note that 170,000 cells were used per construct; N/TERT1 cells must be used from plates that are 30% confluent- two 30% confluent 90 mm tissue culture dishes give more than enough cells.The authors thank Dr. Jim Rheinwald and Dr. Ellen H. van den Bogaard for their generous gift of N/TERT cell lines. | ||
Centrifuge | Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R | (standard lab equipment) | |
Computational Software | MATLAB | MATLAB 2020a | MathWorks, Natick, MA. |
Confocal Microscope | Leica TCS SPEII confocal | Laser scanning confocal. Can be replaced with other confocals or deconvolution microscopy. | |
Cover Glass (22 x 22) | Fisher Scientific | 12-545F | 0.13-0.17 mm No.1 Thickness |
Cyanoacrylate super glue or silicone grease | Glue Masters | #THI0102 | Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate; super glue is preferred |
DMEM media base | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-013-CM; Lot # 26119007 | DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
DMEM/F-12 50/50 | Corning; Mediatech, Inc | REF # 10-090-CV; Lot # 21119006 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Ethanol | Decon Labs | #V1101 | (standard lab reagent) |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | Cat # FB12999102, Lot # AE29451050 | Research Grade Fetal Bovine Serum, Triple 0.1 um sterile filtered |
Fine tip forceps | Fine Science Tools | #11295-00 | Dumont #5 forceps |
Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218 | Made up in 0.1% BSA in PBS |
Hydrocortisone | Alpha Easar | Lot # 5002F2A | made up in DMSO |
Insulin (human) | Peprotech | Lot # 9352621 | |
Inverted Light/Phase Contrast Microscope | VWR | 76317-470 | (standard lab equipment) |
Isoproterenol | Alfa Aesar | #AAJ6178806 | DL-Isoproterenol hydrochloride, 98% |
Keratinocyte-SFM (1x) media base | Gibco; Life Technologies Corporation | REF #: 10724-011; Lot # 2085518 | Keratinocyte-SFM (1X); serum free medium |
L-Ascorbic Acid | Fisher Chemical | Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7 | Crystalline. L-Ascorbic acid can also be purchased as a salt |
L-glutamine (solid) | Fisher Bioreagents | CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9 | L-Glutamine, white crystals or Crystalline powder |
MCDB 131 media base | Gen Depot | CM034-050, Lot # 03062021 | MCDB 131 Medium Base, No L-Glutamine, sterile filtered |
Metal punches | Sona Enterprises (SE) | 791LP, 12PC | Hollow Leather Punch Set, High Carbon Steel, Hardness: 48HRC; (various sizes including): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". This punch set is helpful, but x-acto knife can work as well. Size of metal punch that works well for 12 well transwell VHSE is 3/8" or 1/2". |
Methanol | Fisher Chemical | CAS # 67-56-1 | (optional). For clearing dehydration step. |
Methyl Salicylate | Fisher Chemical | O3695-500; Lot # 164535; CAS # 119-36-8 | (optional). For clearing. |
Microtubes, 1.7 mL | Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics | Cat # 24-282; Lot # 19467 | 1.7 ml Microtubes, Clear; Boilproof, Polypropulene, Certified Rnase, Dnase, DNA, PCR inhibitor and endotoxin-Free |
PBS, 10x Culture grade or autoclaved | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. |
PBS, 1x Culture grade, (-) Calcium, (-) magnesium | Genesee Scientific Corporation | Ref # 25-508; Lot # 07171015 | |
PBS, 1x non-Culture grade | APEX Bioresearch Products | Cat # 20-134, Lot # 202237 | PBS Buffer, 10x Dry Pack; add contents of pack into container and add water to 1 liter to produce 10x concentrated. Dilute to 1x with water. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 15140-122, Lot # 2199839 | Pen Strep (10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 ug/mL Streptomycin) |
Petri Dish, glass, small | Corning | PYREX 316060 | (optional). To be used as a clearing container |
Petri Dishes, 100 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | Use for making up PDMS. |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H04719H035 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Base, Dow Corning, Midland, MI) |
Dow Corning | GMID 02065622, Batch # H047JC4003 | DOWSIL 184, Silicone Elastomer Curing Agent | |
note: PDMS is usually sold as a kit that includes both the base and curing agent components. | |||
Positive Displacement Pipettes (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L | M1000 pipette capacity (100-1000 uL); M250 pipette capacity to 250 uL |
Positive Displacement Tips/Pistons (1000 & 250 uL) | Gilson | 1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S | Sterilized capillaries and pistons |
Round tipped scoopula | (optional; standard lab equipment) For manipulation of VHSEs prior to imaging | ||
Supplements for Keratinocyte-SFM media | Gibco; Life Technologies Corporation | Ref # 37000-015, Lot # 2154180 | Contains EGF Human Recombinant (Cat # 10450-013), Bovine Pituitary Extract (Cat # 13028-014) |
Tissue Culture Plate Inserts, 12 well size, 3 µm pore size | Corning; Costar | REF # 3462 – Clear; Lot # 14919057 | Transwell; 12 mm Diameter Inserts, 3.0 um pore size, tissue culture treated, polyester membrane, polystyrene plates, |
Tissue Culture Plates, 12 well size | Greiner Bio-one; CellStar | Cat # 665 180; Lot # E18103QT | 12 well cell culture plate; sterile, with lid; products are sterile, free of detectable Dnase, Rnase, human DNA and pyrogens. Contents non-cytotoxic |
Tissue Culture Plates, 60.8cm^2 growth area | Genesee Scientific Corporation | Cat # 25-202; Lot No: 191218-177B | Tissue culture dishes; treated, growth area 60.8 cm^2; sterile, Dnase, Rnase, Pyrogen Free; virgin polystyrene |
Triton x 100 | Ricca Chemical Company | Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34 | Wetting agent |
Trypsin 0.25% | Corning; Mediatech, Inc | Ref # 25-053-CI | 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium bicarbonate |
Type 1 Collagen isolated from Rat tail | Pel-Freez Biologicals | 56054-1 | Sprauge-Dawley rat tails can be purchased frozen from Pel-Freez or other suppliers. Collagen can be isolated from the tail tendons. Isolation Protocol references [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958] .Alternatively, high concentration rat-tail collagen can be purchased from suppliers including Corning (Catalog Number: 354249) |
Vaccum chamber, benchtop | Bel-Art | F42010-0000 | (standard lab equipment) |
Handheld Precision knife | X-Acto | X3311 | (X-Acto knife optional if purchased steel punches) |