Un modello di ratto sprague Dawley ortotopico singenico con amputazione per controllare il tasso di metastasi
Summary
Qui, viene descritto un impianto ortotopico singenico seguito da una procedura di amputazione dell’osteosarcoma con metastasi polmonari spontanee che può essere utilizzato per l’indagine preclinica della biologia delle metastasi e lo sviluppo di nuove terapie.
Abstract
Il più recente progresso nel trattamento dell’osteosarcoma (OS) si è verificato nel 1980 quando la chemioterapia multi-agente ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza globale rispetto alla sola chirurgia. Per affrontare questo problema, lo scopo dello studio è quello di perfezionare un modello meno noto di OS nei ratti con un approccio chirurgico istologico, di imaging, biologico, di impianto e amputazione completo che prolunga la sopravvivenza. Abbiamo usato un modello di ratto singenico Sprague-Dawley (SD) immunocompetente e surclassato con linea cellulare UMR106 OS impiantata (proveniente da un ratto SD) con impianti di tumore tibiale ortotopico in ratti maschi e femmine di 3 settimane per modellare il sistema operativo pediatrico. Abbiamo scoperto che i ratti sviluppano tumori polmonari primari e metastatici riproducibili e che le amputazioni degli arti a 3 settimane dopo l’impianto riducono significativamente l’incidenza di metastasi polmonari e prevengono morti inaspettate. Istologicamente, le OS primarie e metastatiche nei ratti erano molto simili alla OS umana. Usando metodi immunoistochimici, lo studio mostra che la OS di ratto è infiltrata con macrofagi e cellule T. Un’indagine sull’espressione proteica delle cellule OS rivela che questi tumori esprimono chinasi della famiglia ErbB. Poiché queste chinasi sono anche altamente espresse nella maggior parte dei sistemi operativi umani, questo modello di ratto potrebbe essere utilizzato per testare gli inibitori della via ErbB per la terapia.
Introduction
L’osteosarcoma (OS) è il tumore osseo primario più comune nei bambini, negli adolescenti e nei giovani adulti. Il più recente progresso nel trattamento della OS si è verificato nel 1980 quando la chemioterapia multi-agente ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza globale rispetto alla sola chirurgia1. La OS si sviluppa durante la rapida crescita ossea, che si verifica in genere nelle ossa tubolari lunghe come femore, tibia e omero. Sono caratterizzati da un aspetto osteolitico, osteoblastico o misto con notevole reazione periostale2. La chemioterapia e la resezione chirurgica possono migliorare l’esito per i pazienti con una sopravvivenza a 5 anni per il 65% deipazienti 2,3. Sfortunatamente, i pazienti con OS di alto grado con malattia metastatica hanno una sopravvivenza del 20%. La OS invade a livello regionale e metastatizza principalmente ai polmoni o ad altre ossa ed è più diffusa nei maschi. Il bisogno più impellente per questi giovani pazienti è una nuova terapia che prevenga ed elimini la vitalità delle metastasi a distanza.
I modelli pre-clinici della OS sono stati esaminati4,5,6,7 e sono stati sviluppati pochi modelli immunocompetenti disponibili che utilizzano l’amputazione della OS ortotopica. Nel 2000, un modello importante è stato sviluppato utilizzando topi BALB / c con OS singenico ortotopico e amputazione8. Rispetto a questo modello murino, il modello di ratto si basa su animali geneticamente allevati e 10 volte più grandi che portano ad alcuni vantaggi. Il modello umR106 di ratto è stato sviluppato da un sistema operativo indotto da 32P in un ratto Sprague Dawley (SD), che è stato derivato in una linea cellulare9. Nel 2001, l’impianto ortotopico di UMR106-01 è stato descritto per la prima volta in tibie impiantate di topi atimici con sviluppo rapido e coerente del tumore primario e caratteristiche radiologiche e istologiche in comune con la OS nell’uomo. Le metastasi polmonari si sono sviluppate e dipendevano dal posizionamento ortotopico di UMR106 nel microambiente osseo10. Nel 2009, Yu et al.11 hanno stabilito un modello di ratto con sistema operativo ortotopico del femore riproducibile utilizzando cellule UMR106 in ratti SD maschi più grandi. Il successo degli impianti tumorali e il tasso di metastasi polmonari nei ratti senza amputazione erano simili ai dati qui presentati. In questo studio, è stata eseguita un’amputazione aggiuntiva al modello utilizzando ratti giovani, il che ha suggerito che i tempi di rimozione del tumore primario sono cruciali nella modellazione della OS, in particolare in relazione alla progressione metastatica. Con questo perfezionamento, l’amputazione e l’imaging in vivo migliorano questo modello per gli studi pre-clinici per la valutazione di nuovi farmaci per la OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
I ratti con impianti tibiali OS sviluppano tumori misurabili entro 3 settimane dopo l’impianto. Se gli arti con tumori vengono amputati 3 settimane dopo l’impianto, l’incidenza di metastasi polmonari si riduce in modo significativo. I sistemi operativi sono sia osteolitici che osteoblastici. I ratti senza amputazione sviluppano metastasi polmonari multiple e di dimensioni variabili, osservate mediante radiografia o necroscopia entro 7 settimane dall’impianto. EGFR, ErbB2 ed ErbB4 sono espressi in OS UMR106 di ratto, simi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento NIH attraverso il National Cancer Institute, sovvenzione # CA228582. Shun Ishiyama sta attualmente ricevendo una sovvenzione da Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
Referências
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