Un modelo de rata Sprague Dawley de osteosarcoma ortotópico singénico con amputación para controlar la tasa de metástasis
Summary
Aquí, se describe un implante ortotópico singénico seguido de un procedimiento de amputación del osteosarcoma con metástasis pulmonar espontánea que se puede utilizar para la investigación preclínica de la biología de la metástasis y el desarrollo de nuevas terapias.
Abstract
El avance más reciente en el tratamiento del osteosarcoma (SG) ocurrió en la década de 1980, cuando se demostró que la quimioterapia multiagente mejora la supervivencia general en comparación con la cirugía sola. Para abordar este problema, el objetivo del estudio es refinar un modelo menos conocido de SG en ratas con un enfoque quirúrgico histológico, de imágenes, biológico, de implantación y amputación integral que prolongue la supervivencia. Utilizamos un modelo de rata singénica inmunocompetente y desanguínea de Sprague-Dawley (SD) con línea celular de SG UMR106 implantada (originada en una rata SD) con implantes de tumores tibiales ortotópicos en ratas macho y hembra de 3 semanas de edad para modelar la SG pediátrica. Encontramos que las ratas desarrollan tumores pulmonares primarios y metastásicos reproducibles, y que las amputaciones de extremidades a las 3 semanas después de la implantación reducen significativamente la incidencia de metástasis pulmonares y previenen muertes inesperadas. Histológicamente, los SG primarios y metastásicos en ratas fueron muy similares a los OS humanos. Utilizando métodos de inmunohistoquímica, el estudio muestra que los SG de rata están infiltrados con macrófagos y células T. Un estudio de expresión de proteínas de las células de la SG revela que estos tumores expresan quinasas de la familia ErbB. Dado que estas quinasas también están altamente expresadas en la mayoría de los SG humanos, este modelo de rata podría usarse para probar los inhibidores de la vía ErbB para la terapia.
Introduction
El osteosarcoma (SG) es el tumor óseo primario más común en niños, adolescentes y adultos jóvenes. El avance más reciente en el tratamiento de la SG ocurrió en la década de 1980 cuando se demostró que la quimioterapia multiagente mejora la supervivencia general en comparación con la cirugía sola1. La SG se desarrolla durante el crecimiento óseo rápido, que generalmente ocurre en huesos tubulares largos como el fémur, la tibia y el húmero. Se caracterizan por una apariencia osteolítica, osteoblástica o mixta con notable reacción perióstica2. La quimioterapia y la resección quirúrgica pueden mejorar el resultado para los pacientes con una supervivencia a 5 años para el 65% de los pacientes2,3. Desafortunadamente, los pacientes con SG de alto grado con enfermedad metastásica tienen una supervivencia del 20%. La SG invade regionalmente y hace metástasis principalmente a los pulmones u otros huesos y es más frecuente en los hombres. La necesidad más apremiante para estos pacientes jóvenes es una terapia novedosa que prevenga y elimine la viabilidad de las metástasis a distancia.
Se han revisado modelos preclínicos de SG4,5,6,7 y se han desarrollado pocos modelos inmunocompetentes disponibles que utilizan la amputación de SG ortotópica. En el año 2000, se desarrolló un modelo importante utilizando ratones BALB/c con SG singénica ortotópica y amputación8. En comparación con este modelo de ratón, el modelo de rata se basa en animales genéticamente desanguíneos y 10 veces más grandes, lo que lleva a algunas ventajas. El modelo UMR106 de rata se desarrolló a partir de una SG inducida por 32P en una rata Sprague Dawley (SD), que se derivó en una línea celular9. En 2001, la implantación ortotópica de UMR106-01 se describió por primera vez en tibias implantadas de ratones atímicos con desarrollo rápido y consistente de tumores primarios y características radiológicas e histológicas en común con la SG en humanos. Las metástasis pulmonares se desarrollaron y dependieron de la colocación ortotópica de UMR106 en el microambiente óseo10. En 2009, Yu et al.11 establecieron un modelo de rata ortotópica de rata OS ortotópica reproducible utilizando células UMR106 en ratas SD macho más grandes. Los implantes tumorales exitosos y la tasa de metástasis pulmonar en ratas sin amputación fueron similares a los datos presentados aquí. En este estudio, se realizó una amputación adicional al modelo utilizando ratas jóvenes, lo que sugirió que el momento de la extirpación del tumor primario es crucial en el modelado de la SG, especialmente en relación con la progresión metastásica. Con este refinamiento, la amputación y las imágenes in vivo mejoran este modelo para estudios preclínicos para la evaluación de nuevos fármacos para la SG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las ratas con implantes tibiales de SG desarrollan tumores medibles a las 3 semanas posteriores a la implantación. Si las extremidades con tumores se amputan 3 semanas después de la implantación, la incidencia de metástasis pulmonar se reduce significativamente. Los SG son tanto osteolíticos como osteoblásticos. Las ratas sin amputación desarrollan metástasis pulmonares que son múltiples y de tamaño variable, observadas por radiografía o en la necropsia a las 7 semanas después de la implantación. EGFR, ErbB2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamiento de los NIH a través del Instituto Nacional del Cáncer, subvención # CA228582. Shun Ishiyama está recibiendo actualmente una subvención de Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
Referências
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