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Biologia do Desenvolvimento

सामूहिक आंदोलन विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक माउस भ्रूणीय पैलेटल मेसेंचिम कोशिकाओं के अलगाव और समय-चूक इमेजिंग

Published: February 13, 2021
doi:
10.3791/62151
, , ,
1Department of Anatomy and Cell Biology,University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics,Eotvos University

Summary

हम दो आयामी (2डी) विकास और घाव-मरम्मत परख के समय-चूक इमेजिंग के लिए प्राथमिक माउस भ्रूणीय महल मेसेंचिमल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम सेल-स्ट्रीम गठन और दिशात्मक गतिशीलता निर्धारित करने के लिए समय-चूक इमेजिंग डेटा के विश्लेषण के लिए कार्यप्रणाली भी प्रदान करते हैं।

Abstract

तालू का विकास एक गतिशील प्रक्रिया है, जिसमें जीभ के बगल में द्विपक्षीय ताल अलमारियों का ऊर्ध्वाधर विकास शामिल है जिसके बाद ऊंचाई और जीभ के ऊपर संलयन होता है। इस प्रक्रिया में दोष फांक तालु, एक आम जन्म दोष का कारण बनते हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि पैलेटल शेल्फ ऊंचाई में एक रीमॉडलिंग प्रक्रिया शामिल है जो शेल्फ के अभिविन्यास को ऊर्ध्वाधर से क्षैतिज में बदल देती है। इस डायनेमिक रिमॉडलिंग में पैलेटल शेल्फ मेसेंचिमल कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करना मुश्किल रहा है। समय-चूक-इमेजिंग आधारित मात्रात्मक विश्लेषण हाल ही में यह दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि प्राथमिक माउस भ्रूणीय पाॅलल मेसेंचिमल (एमईपीएम) कोशिकाएं सामूहिक आंदोलन में स्वयं को व्यवस्थित कर सकती हैं। मात्रात्मक विश्लेषण तालू ऊंचाई दोषों के साथ एक माउस मॉडल से उत्परिवर्ती MEPM कोशिकाओं में मतभेदों की पहचान कर सकता है । यह पत्र E13.5 भ्रूण से एमईपीएम कोशिकाओं को अलग-थलग करने और संस्कृति देने के तरीकों का वर्णन करता है- विशेष रूप से समय-चूक इमेजिंग के लिए- और सामूहिक आंदोलन के विभिन्न सेलुलर गुणों का निर्धारण करने के लिए, जिसमें स्ट्रीम निर्माण, आकार संरेखण और दिशा के हठ के उपाय शामिल हैं। यह posits है कि MEPM कोशिकाओं को ऊंचाई की गतिशील प्रक्रिया के दौरान पैलेट शेल्फ mesenchyme की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक प्रॉक्सी मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं । ये मात्रात्मक तरीके क्रैनियोफेशियल क्षेत्र में जांचकर्ताओं को नियंत्रण और उत्परिवर्ती कोशिकाओं में सामूहिक आंदोलन विशेषताओं का आकलन करने और तुलना करने की अनुमति देंगे, जो पैलेट शेल्फ ऊंचाई के दौरान मेसेंचिमल रिमॉडलिंग की समझ को बढ़ाएगा । इसके अलावा, एमईपीएम कोशिकाएं सामान्य रूप से सामूहिक सेल आंदोलन की जांच के लिए एक दुर्लभ मेसेंचिमल सेल मॉडल प्रदान करती हैं।

Introduction

तालू विकास का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है क्योंकि तालुजीनाइस में दोष फांक तालु का कारण बनते हैं – एक सामान्य जन्म दोष जो अलग-अलग मामलों में या सैकड़ों सिंड्रोम के हिस्से के रूप में होता है1,2। भ्रूण तालू का विकास एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें भ्रूणीय ऊतक का आंदोलन और संलयन शामिल है। इस प्रक्रिया को चार प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1) पैलेटल अलमारियों का शामिल होना, 2) जीभ के बगल में पाताल अलमारियों का ऊर्ध्वाधर विकास, 3) जीभ के ऊपर पाताल अलमारियों की ऊंचाई, और 4) मिडलाइन1,3,4पर पैलेट अलमारियों का संलयन। पिछले कई दशकों में, कई माउस म्यूटेंट की पहचान की गई है जो प्रकट फांक तालु5,6,7,8। इन मॉडलों के लक्षण वर्णन ने पैलेट शेल्फ प्रेरण, प्रसार और संलयन चरणों में दोषों का संकेत दिया है; हालांकि, पाताल शेल्फ ऊंचाई दोष दुर्लभ किया गया है । इस प्रकार, पाताल शेल्फ ऊंचाई की गतिशीलता को समझना अनुसंधान का एक पेचीदा क्षेत्र है।

पैलेटल शेल्फ ऊंचाई दोषों के साथ कुछ माउस म्यूटेंट के सावधानीपूर्वक विश्लेषण ने वर्तमान मॉडल को दिखा दिया है कि तालूल शेल्फ का बहुत पूर्वकाल क्षेत्र फ्लिप करने के लिए प्रकट होता है, जबकि तालू1,3,4के पीछे के क्षेत्रों के लिए क्षैतिज आंदोलन या “रीमॉडलिंग” के लिए एक ऊर्ध्वाधर 9,10,11. पाकल शेल्फ के मध्यीय किनारे एपिथेलियम की संभावना इस रीमॉडलिंग के लिए आवश्यक सिग्नलिंग शुरू करती है, जिसे तब पैलेटल शेल्फ मेसेनचिम द्वारा संचालित किया जाता है। हाल ही में, कई शोधकर्ताओं ने माउस मॉडल में पाताल शेल्फ ऊंचाई में देरी की पहचान की है जिसमें क्षणिक मौखिक आसंजन दिखाया गया है जिसमें पाताल अलमारियों12,13शामिल हैं । मेसेंचिमल रिमॉडलिंग में क्षैतिज दिशा में उभार बनाने के लिए कोशिकाओं का पुनर्गठन शामिल है, जबकि साथ ही ऊर्ध्वाधरदिशा9,10,14में पैलेटल शेल्फ को वापस लेना। पाताल शेल्फ ऊंचाई और अंतर्निहित मेसेन्चिमल रिमॉडलिंग को प्रभावित करने के लिए प्रस्तावित कई तंत्रों में सेल प्रसार15 , 16,17,केमोटेक्टिक ग्रेडिएंट18और बाह्राश मैट्रिक्स घटक19,20हैं । एक महत्वपूर्ण सवाल उठा: क्या पैलेटल शेल्फ ऊंचाई में देरी Specc1l-कमीचूहों में भी आंशिक रूप से पैलेटल शेल्फ रीमॉडलिंग में एक दोष के कारण मनाया जाता है, और क्या यह रीमॉडलिंग दोष प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं के व्यवहार में एक आंतरिक दोष में प्रकट हो सकता है21?

जीनअभिव्यक्ति22, 23, 24, 25, 26, 27,28,29,और कुछ प्रसार30,31और प्रवास25,31, 32 शामिल कई अध्ययनों के लिए क्रैनियोफेशियल क्षेत्र में प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग किया गयाहै। , लेकिन सामूहिक सेल व्यवहार विश्लेषण के लिए कोई नहीं । एमईपीएम कोशिकाओं की समय-चूक इमेजिंग 2डी संस्कृति और घाव-मरम्मत परख में की गई थी ताकि यह दिखाया जा सके कि एमईपीएम कोशिकाओं ने दिशात्मक आंदोलन प्रदर्शित किया और सामूहिक आंदोलन21के घनत्व-निर्भर सेल धाराओं-विशेषताओं का गठन किया। इसके अलावा, Specc1l उत्परिवर्ती कोशिकाओं संकरा सेल धाराओं का गठन किया और अत्यधिक चर सेल प्रवास प्रक्षेप पथ दिखाया । समन्वित गतिशीलता की इस कमी को Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण13,21में तालू ऊंचाई में देरी में योगदान करने के लिए माना जाता है । इस प्रकार, प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं का उपयोग करने वाले ये अपेक्षाकृत सरल परखें पैलेटल शेल्फ ऊंचाई के दौरान मेसेंचिमल रीमॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए प्रॉक्सी के रूप में काम कर सकती हैं। यह पेपर 2डी और घाव-मरम्मत परख के लिए प्राथमिक एमईपीएम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के साथ-साथ समय-चूक इमेजिंग और विश्लेषण का वर्णन करता है।

Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों को उनके दिशा-निर्देशों और विनियमों (प्रोटोकॉल संख्या: 2018-2447) के अनुसार, कुमसी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ किया गया था । 1. ह?…

Representative Results

पाताल अलमारियों का विच्छेदन चित्र 1में दर्शाया गया है । चीरों का अनुक्रम ऊतक की फिसलन को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सिर(चित्रा 1A,B)को हटाने के बाद, निचले जबड़े को हटा ?…

Discussion

पाताल शेल्फ ऊंचाई क्षैतिज रिमॉडलिंग इवेंट 1, 3 ,4,9,11के लिए एक ऊर्ध्वाधर है। यह पोस्ट किया गया है कि इस रीमॉडलिंग प्रक्रिया को समन्वयपूर्वक व्?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस परियोजना के हिस्से में स्वास्थ्य अनुदान DE026172 (I.S.), और GM102801 (A.C. द्वारा समर्थित किया गया था। आई एस को बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस (COBRE) अनुदान (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज P20 GM104936), कंसास आईडीए नेटवर्क फॉर बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस ग्रांट (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज P20 GM103418), और कंसास इंटेलेक्चुअल एंड डेवलपमेंटल डिसएबिलिटी रिसर्च सेंटर (KIDDRC) ग्रांट (U54 Eunice Shriver राष्ट्रीय संस्थान) द्वारा भाग में भी समर्थन किया गया था । HD090216) ।

Materials

Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
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Referências

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Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).
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