Apresentamos um protocolo de isolamento e cultura de células mesenquimais palatinas embrionárias primárias para imagens de lapso de tempo de crescimento bidimensional (2D) e ensaios de reparação de feridas. Também fornecemos a metodologia para análise dos dados de imagem de lapso de tempo para determinar a formação de fluxo celular e a motilidade direcional.
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Artigo de método
Isolamento e imagem de lapso de tempo das células mesenquima palatinas embrionárias do camundongo primário para analisar atributos de movimento coletivo
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento do paladar é um processo dinâmico, que envolve o crescimento vertical das prateleiras palatais bilaterais ao lado da língua seguidas de elevação e fusão acima da língua. Defeitos nesse processo levam à fissura palatina, um defeito comum de nascimento. Estudos recentes têm demonstrado que a elevação da prateleira palatal envolve um processo de remodelação que transforma a orientação da prateleira de uma vertical para uma horizontal. O papel das células mesenquimais da prateleira palatal nesta remodelagem dinâmica tem sido difícil de estudar. A análise quantitativa baseada em imagens de lapso de tempo foi recentemente usada para mostrar que as células mesenquimais palatinas embrionárias primárias do camundongo (MEPM) podem se auto-organizar em um movimento coletivo. Análises quantitativas poderiam identificar diferenças nas células mutantes mepm de um modelo de rato com defeitos de elevação do paladar. Este artigo descreve métodos para isolar e cultivar células MEPM de embriões E13.5 - especificamente para imagens de lapso de tempo - e determinar vários atributos celulares do movimento coletivo, incluindo medidas para formação de fluxo, alinhamento de forma e persistência de direção. Ele afirma que as células MEPM podem servir como um modelo proxy para estudar o papel do mesenquime de prateleira palatal durante o processo dinâmico de elevação. Esses métodos quantitativos permitirão aos pesquisadores do campo craniofacial avaliar e comparar atributos de movimento coletivo no controle e células mutantes, o que aumentará a compreensão da remodelagem mesenquimal durante a elevação da prateleira palatal. Além disso, as células MEPM fornecem um raro modelo de célula mesenquimal para investigação do movimento celular coletivo em geral.
Introdução
O desenvolvimento palaciano tem sido estudado extensivamente como defeitos na palatogênese levam à fissura palatina - um defeito de nascimento comum que ocorre em casos isolados ou como parte de centenas de síndromes1,2. O desenvolvimento do paladar embrionário é um processo dinâmico que envolve movimento e fusão de tecido embrionário. Este processo pode ser dividido em quatro etapas principais: 1) indução de prateleiras palatais, 2) crescimento vertical das prateleiras palatais ao lado da língua, 3) elevação das prateleiras palatais acima da língua, e 4) fusão das prateleiras palatais na linha média
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados com protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da KUMC, de acordo com suas diretrizes e regulamentos (Número do Protocolo: 2018-2447).
1. Colher E13,5 embriões
- Eutanize camundongos gestantes usando uma câmara de inalação de CO2 ou por um procedimento aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Imediatamente proceder à dissecação.
- Exponha a metade inferior da cavidade abdominal removendo a pele e o peritônio. Extirpar ambos os chifres do útero, que contêm os embriões E13.5.
- Coloque brevemente ....
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Resultados
A dissecação das prateleiras palatais é ilustrada na Figura 1. A sequência de incisões é projetada para minimizar o deslizamento do tecido. Após a remoção da cabeça (Figura 1A,B), a mandíbula inferior é removida(Figura 1B,C). A incisão da parte superior da cabeça (Figura 1C,D) é feita para estabilizar o tecido quando colocado de cabeça para baixo
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Discussão
A elevação da prateleira palatal constitui um evento de remodelação vertical para horizontal1,3,4,9,11. É postulado que este processo de remodelação requer que as células mesenquimais de prateleira palatal se comportem coordenadamente. As análises com células MEPM do tipo selvagem mostram que esse comportamento celular é intrínseco e pode ser quantitado
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este projeto foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde de bolsas DE026172 (IS) e GM102801 (A.C.). O I.S. também foi apoiado em parte pelo Centro de Excelência em Pesquisa Biomédica (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) e Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copo, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Tubos cônicos, 15 mL (x1) | Sistema operacional | ||
| Debian | análise computacional de imagens de lapso de tempo | ||
| L-Glutamina e Piruvato de Sódio | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Incubadora | Onstage ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Recipiente, Placas Multi-Poços | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Ponta fina #5 Pinça de aço inoxidável (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | dissecção |
| esterilizador de esferas de banho | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Tubos de microcetrífugo, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Tesoura de aço inoxidável micro-dissecante, reta | Roboz | RS-5910 | Dissecção |
| NucBlue (Hoechst) Sondas Live Ready | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Solução de Estreptomicina de Penicilina, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Inserção de Silicone, 2 poços | Ibidi | 80209 | |
| Colher Pequena Perfurada de Aço Inoxidável | Dissecção | MC17C | Fine Science Tools |
| Tesoura, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Estéril(is) 10 cm(s) | Corning | 430293 | |
| Placa(s) estéril de 12 poçosPR1MA | 667512 | ||
| Placa(s) estéril de 6 poçosThermo | Fisher Scientific | 140675 | |
| Estéril PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Pipeta de transferência de bulbo de plástico estéril | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Tripsina, 0,25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Referências
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- La....
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Reimpressões e permissões
