Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung des RNA-Targeting-Enzyms Cas13D (RfxCas13D) in Fliegen.
CasRx, ein Mitglied der RNA-Targeting-Cas13-Familie, ist eine vielversprechende neue Ergänzung der CRISPR/Cas-Technologien in der effizienten Reduktion von Gentranskripten mit einem attraktiven Off-Target-Profil sowohl auf zellulärer als auch auf organismischer Ebene. Kürzlich wurde berichtet, dass das CRISPR/CasRx-System verwendet werden kann, um eine ubiquitäre und gewebespezifische Reduktion von Gentranskripten in Drosophila melanogaster zu erreichen. Dieses Papier beschreibt die Methoden aus der jüngsten Arbeit, bestehend aus drei Teilen: 1) ubiquitäres in vivo endogenes RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System; 2) ubiquitäre in vivo exogene RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System; und 3) gewebespezifisches in vivo RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System. Zu den beobachteten Wirkungen des RNA-Targetings gehören gezielte genspezifische phänotypische Veränderungen, eine gezielte RNA-Transkriptreduktion und gelegentliche Letalitätsphänotypen, die mit einer hohen Expression des CasRx-Proteins und der Kollateralaktivität assoziiert sind. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass das CasRx-System in der Lage ist, die RNA-Transkriptreduktion auf organismischer Ebene programmierbar und effizient zu reduzieren, was zeigt, dass in vivo Transkriptom-Targeting und Engineering machbar ist und die Grundlage für zukünftige in vivo CRISPR-basierte RNA-Targeting-Technologien legt.
Seit dem Aufkommen der CRISPR-Technologien (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) liegt ein Großteil des Fokus in diesem Bereich auf der DNA-Editierung, die transformative Anwendungen in der Medizin und Biotechnologie bietet1. Eine dauerhafte Veränderung von DNA-Sequenzen ist jedoch aus ethischen Gründen nicht immer erwünscht. Vor diesem Hintergrund begannen jüngste Studien mit der Entwicklung von CRISPR-basierten Werkzeugen für das Targeting von RNA und zeigten, dass CRISPR-Technologien tatsächlich für das RNA-Targeting in einer Vielzahl von biologischen Systemen verwendet werden können2,3,4,5,6,7. In vielen dieser getesteten Systeme ist der derzeit weit verbreitete Ansatz für die Targeting-RNA und Transkriptreduktion die RNA-Interferenz (RNAi), die bei weitem nicht perfekt ist und oft eine unterschiedliche Wirksamkeit und eine hohe Off-Target-Aktivität aufweist, wenn sie in vivo verwendet wird8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Angesichts des Status dieser Technologien lohnt es sich daher, die Potenziale von CRISPR-basierten Tools für das RNA-Targeting weiter zu erforschen.
Eine bemerkenswerte aktuelle Studie berichtete, dass die Ribonuklease CasRx, ein Mitglied der Cas13d-Klasse, die Gentranskriptspiegel in der menschlichen Zellkultur effizient reduzieren kann und ein attraktives Off-Target-Profil besitzt4. Dieser Befund führte zu der Frage, ob diese neue Ribonuklease ihre Wirksamkeit und niedrige Off-Target-Rate für das RNA-Targeting auf organismischer Ebene aufrechterhalten kann. Eine kürzlich durchgeführte Studie befasste sich mit dieser Frage, indem sie zeigte, dass das CasRx-System verwendet werden kann, um eine ubiquitäre und gewebespezifische Reduktion von Gentranskripten in Drosophila melanogaster5 zu erreichen.
Um die Benutzerfreundlichkeit dieses kürzlich veröffentlichten Ansatzes zu rationalisieren, beschreibt dieses Protokoll die Methoden aus dieser jüngsten Arbeit, die aus drei Hauptteilen besteht: 1) allgegenwärtiges In-vivo-RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System; 2) ubiquitäre in vivo exogene RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System; und 3) gewebespezifisches In-vivo-RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System.
Guide RNAs (gRNA), die auf verschiedene Zielgene unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors abzielen, wurden entworfen und Fliegenlinien erzeugt, die diese gRNA-haltigen Konstrukte exprimieren. CasRx-Konstrukte, die entweder unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors oder eines UFSt-Promotors (Conditional Upstream Activation Sequence) stehen, der durch den GAL4-Transkriptionsfaktor aktivierbar ist, wurden ebenfalls entworfen und Flylines erzeugt, die diese CasRx-haltigen Konstrukte beherbergen. Katalytisch inaktive CasRx-Konstrukte, dCasRx, wurden als Negativkontrollen konzipiert und verwendet. Das ubiquitäre RNA-Targeting in Fliegen wird durch Kreuzung von gRNA-exprimierenden Fliegenlinien mit ubiquitär CasRx-exprimierenden Fliegenlinien erreicht. Die Nachkommen, die sowohl das gRNA-Konstrukt exprimieren, das auf ein bestimmtes Gentranskript abzielt, als auch das CasRx-Protein haben eine allgegenwärtige Reduktion der zielgerichteten Gentranskripte. Ein gewebespezifisches RNA-Targeting in Fliegen wird erreicht, indem zunächst gRNA-exprimierende Fliegen mit UASt-CasRx-exprimierenden Fliegen kreuzen und transheterozygote Fliegen erhalten werden, die sowohl gRNA- als auch UASt-CasRx-Konstrukte tragen. Solche Fliegen wiederum werden mit gewebespezifischen GAL4-exprimierenden Fliegen gekreuzt, was zur Erzeugung einer gewebespezifischen CasRx-Expression und eines RNA-Targetings bei Fliegen führt.
Die programmierbare Natur des CasRx-Systems bietet die Möglichkeit der Anpassung und Optimierung, um eine hohe Wirksamkeit und eine geringe Off-Target-Aktivität für das In-vivo-RNA-Targeting zu erreichen. Mögliche Anwendungen von CRISPR-basiertem RNA-Targeting sind zahlreich, einschließlich des Ersatzes von RNAi im Labor und des Beitrags zur Insektenvektorkontrolle in freier Wildbahn. Von letzterem ist einer der globalen unerfüllten Bedürfnisse die Entwicklung effizienter Werkzeuge zur Bekämpfung von Infektionen von RNA-Viren, die über Moskitos übertragen werden. Viele RNA-Viren wie Dengue-, Zika- und Chikungunya-Virus werden über Moskitos übertragen, was die menschliche Gesundheit beeinträchtigt und zur Mortalität beiträgt. Es wurden viele Vorschläge für die Entwicklung von Mückenpopulationen mit Virusresistenz zur Krankheitsprävention gemacht; Keine aktuelle Technologie ist jedoch in der Lage, Moskitos gleichzeitig gegen alle signifikanten RNA-Viren resistent zu machen18,19,20,21,22,23. RNA-targeting-Cas-Systeme können einen Ausgangspunkt für eine solche Technologie bieten, indem sie eine programmierbare Plattform für das Targeting aller durch Mücken übertragenen RNA-Viren ermöglichen.
Mit drei verschiedenen Anwendungsdesigns des CasRx-Systems demonstrierte diese Arbeit in vivoprogrammierbares RNA-Targeting in Fliegen. Die verschiedenen Strategien sind auf unterschiedliche Projektanforderungen ausgerichtet, z. B. endogenes versus exogenes Gen-Targeting und allgegenwärtiges versus gewebespezifisches RNA-Targeting. Die Wirkungen des RNA-Targetings umfassten zielgenspezifische phänotypische Veränderungen, die Reduzierung des Ziel-RNA-Transkripts und gelegentliche Letalitätsphänotypen, die mit einer hohen Expression des CasRx-Proteins und der Kollateralaktivität assoziiert sind. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass das CasRx-System in der Lage ist, die RNA-Transkriptreduktion auf organismischer Ebene programmierbar und effizient zu reduzieren.
Einer der Schlüsselfaktoren für ein erfolgreiches Customizing des CasRx-Systems ist das Design von gRNAs. Insbesondere ist der folgende Rat zu beachten: Die Zielsequenz ist etwa 30 Nukleotide lang, die Länge der Poly-U-Dehnungen in der Zielsequenz beträgt 4 Basenpaare oder weniger, der GC-Gehalt der Zielsequenz liegt im Bereich von 30% – 70%, die Zielsequenz wird nicht vorhergesagt, um starke RNA-Haarnadelstrukturen zu bilden, und die Zielsequenz enthält eine minimale vorhergesagte sekundäre oder tertiäre RNA-Struktur5.
Neben den gRNA-Designs ist auch der Schritt der Fliegengenetik in jedem Protokoll entscheidend für eine erfolgreiche Implementierung. Das Vorhandensein oder Fehlen der definierten Phänotypen, die von den Eltern in den Nachkommen weitergegeben werden, ist wichtig für die Identifizierung und Quantifizierung von Phänotypen, die durch das CasRx-System in den transheterozygoten Nachkommen induziert werden. Auch das parallele Einrichten von Kontrollkreuzen mit den dCasRx-Fliegen ist hilfreich, um unspezifische Phänotypen in den transheterozygoten Nachkommen auszuschließen.
Es ist erwähnenswert, dass diese Ergebnisse ein Toxizitätsproblem aufdeckten, das durch die allgegenwärtige Expression von CasRx- und dCasRx-Protein im Flug eingeführt wurde, eine Einschränkung des CasRx-Systems. Die allgegenwärtige Expression von CasRx oder dCasRx unter dem Ubiq-Promotor allein, ohne gRNAs, war mit nichttrivialen Fitnesskosten verbunden, da weder Ubiq-CasRx- noch Ubiq-dCasRx-Fliegen als homozygote Linien etabliert werden konnten. Im Gegenteil, UASt-CasRx- und UASt-dCasRx-Fliegen können als gesunde homozygote Bestände etabliert werden, obwohl sie aufgrund des Designs des Kreuzschemas als doppelt ausgewogene Bestände gehalten wurden, eine Tatsache, die die Existenz einer Toxizität unterstützt, die durch die allgegenwärtige CasRx-Proteinexpression induziert wird. Ein weiterer unterstützender Beweis ist, dass in Kontrollexperimenten mit dCasRx, das katalytisch inaktiv ist, die Prozentsätze der Fliegen, die sowohl dCasRx- als auch gRNA-Konstrukte aus der Gesamtzahl der Fliegen in der F1-Generation tragen, durchweg niedriger als 50% waren, das Verhältnis, das basierend auf der Mendelschen Genetik erwartet wurde, wenn keine dCasRx-assoziierte Toxizität vorhanden war. Dies deutete darauf hin, dass die ubiquitäre Expression von dCasRx zusammen mit gRNAs eine Toxizität in der Fliege induziert, was zu einem geringeren Vererbungsverhältnis als erwartet führt. Die Vererbungsverhältnisse von transheterozygoten UASt-dCasRx-, gRNA-, GAL4-Fliegen folgten der Mendelschen Genetik, was wiederum auf die Toxizität hindeutet, die spezifisch durch die ubiquitäre Expression von CasRx- und dCasRx-Proteinen induziert wird. Die Toxizität im CRISPR/Cas-System ist nicht neu. Es hat sich gezeigt, dass hohe Mengen an Cas9-Protein in mehreren Organismen toxisch sind, einschließlich Fliegen29,30,31,32. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat ein maßgeschneidertes GAL4 / UAS-System entwickelt, das die Menge an Cas9-Protein, die in Fliegen exprimiert wird, abstimmen kann, indem ein offener Leserahmen unterschiedlicher Länge zwischen der UAS-Sequenz und der Cas9-Sequenz im UAS-Cas9-Konstrukt hinzugefügt wird33. Daher lohnt es sich, Wege zu erkunden, um die CasRx-induzierte Toxizität durch Abstimmung des CasRx-Proteinexpressionsniveaus zu reduzieren.
Abgesehen von der Toxizität, die durch die ubiquitäre Expression von CasRx- und dCasRx-Proteinen induziert wird, zeigten die Ergebnisse auch eine Letalität im Zusammenhang mit den unspezifischen kollateralen Off-Target-Effekten des CasRx-Systems, ein Merkmal vieler CRISPR-Systeme1,2,7,34. In einigen der CasRx- und nicht-essentiellen Gen-gRNA-exprimierenden Doppel- oder Dreifach-Transheterozygot-Fliegen, zum Beispiel beim Targeting von Notch, haben die transheterozygoten CasRx-Fliegen im Vergleich zu den transheterozgyen dCasRx-Fliegen eine signifikant niedrigere Überlebensrate. In der RNA-seq-Analyse dieser CasRx- und gRNA-exprimierenden transheterozygoten Fliegen wurde sowohl die Reduktion der Ziel-Gentranskript-Spiegel als auch die Reduktion von Nicht-Ziel-Gentranskripten beobachtet. Diese Kollateraleffekte waren CasRx-abhängig und zielabhängig, da sie nur bei transheterozygoten Fliegen beobachtet wurden, die sowohl das CasRx-Protein als auch die gRNA exprimierten. Es ist erwähnenswert, dass eines der Zielgene, weiß, nur eine begrenzte, nicht statistisch signifikante Reduktion der Transkripte zeigte, wenn das weiße Gen von CasRx angegriffen wurde, was im Gegensatz zum klaren Pigmentreduktionsphänotyp stand. Es wird angenommen, dass dies auf die Tatsache zurückzuführen sein könnte, dass 1) der Zeitpunkt der RNA-seq-Probenentnahme nicht gut auf den Zeitpunkt abgestimmt war, zu dem das weiße Gen während der frühen Entwicklung seine maximale Expression erreicht, und 2) die lokalisierte Expression des weißen Gens in den Augen es schwierig macht, die relevanten Gewebe während der frühen Entwicklungsphase zu sammeln, wenn nur die Ganzkörperprobenentnahme möglich ist. Um die Kollateralaktivität im CasRx-System zu reduzieren, sind zukünftige Studien erforderlich, um die Mechanismen, die dem Off-Target-Phänomensystem auf organismischer Ebene zugrunde liegen, vollständig zu verstehen.
Interessanterweise schien eine kürzlich durchgeführte Studie35 , in der RNA-Targeting-Cas13-Werkzeuge in Fliegen beschrieben wurden, die allgemeine Toxizität im Zusammenhang mit der CasRx-Expression aus mehreren möglichen Gründen zu verbessern. Erstens kodierten die Autoren die Cas13-Transgene neu, um die Expression in Drosophila zu optimieren, und verwendeten einen schwächer exprimierenden Promotor (Actin 5C) im Vergleich zu dem in der vorliegenden Studie verwendeten Ubiquitin-Promotor, was wahrscheinlich zu niedrigeren Cas13-Expressionsraten und damit zu einer geringeren Toxizität führte. Tatsächlich wird dies durch die Beobachtungen gestützt, dass die UASt-gesteuerte CasRx- und dCasRx-Expression an sich nicht toxisch war, da diese Studie (und die Autoren in 35) keine offensichtliche Letalität bei UASt-CasRx-Fliegen beobachteten. Darüber hinaus kodierten diese Autoren ihre gRNAs anders als in dieser Studie, was ihre Expression beeinflusst und die Toxizität des Systems in transheterozygoten Cas13/gRNA-Fliegen reduziert haben könnte. Zum Beispiel wurden in ihrer Studie zwei gRNAs mit dem U6: 3-Promotor exprimiert und von tRNAs flankiert, um die gRNA-Verarbeitung bei der tRNA-Reifung zu ermöglichen, ohne CasRx35 zu benötigen. Umgekehrt wurden die gRNAs in dieser Studie als Arrays kodiert, die auf bis zu 4 Stellen pro Gen abzielen und die endogene Cas13-Array-Struktur in Bakterien nachahmen, die das Cas13-Enzym benötigt, um jede gRNA zu verarbeiten. Diese unterschiedlichen Ansätze könnten zu Unterschieden in der gRNA-Expression und anderen Faktoren geführt haben, die inhärente Auswirkungen auf die Toxizität des gesamten Systems haben können. Schließlich zielten Huynh et al. auf andere Gene ab als die in der vorliegenden Studie angesprochenen, was zu Unterschieden in der Target-Cas/gRNA-Interaktion und der Kollateralaktivität führt und Auswirkungen auf die beobachtete Letalität haben kann. Diese Unterschiede in der beobachteten Toxizität rechtfertigen weitere Untersuchungen, um Wege zu finden, wie die Gesamtsysteme verbessert werden können.
Insgesamt ist diese Studie die erste Demonstration eines funktionellen, genetisch kodierten programmierbaren RNA-Targeting-Cas-Systems in D. melanogaster, obwohl eine weitere Optimierung des CasRx-Systems (im Einklang mit dem, was berichtet wird35) erforderlich sein wird, um die Off-Target-assoziierte Letalität weiter zu reduzieren und die Wirksamkeit der CasRx-On-Target-Spaltung zu erhöhen. RNA-Targeting mit Cas-Enzymen ist ein sich schnell entwickelndes Feld mit vielen potenziellen Anwendungen, die von der Insektenvektorkontrolle bis hin zu therapeutischen Anwendungen reichen1,2,3,4,5,6,7, und dieses Protokoll bietet ein Starterpaket für alle, die daran interessiert sind, ihr erstes CasRx-System in Fliegen zu entwerfen, während es mit der Anpassung und weiteren Optimierung des Systems kompatibel ist. Die hier vorgestellten Beispiele zeigen eine Reihe von Ergebnissen, die bei der Implementierung dieses Systems in vivo auftreten können, und können als Benchmarks für andere Benutzer bei der Bewertung der Leistung des CasRx-Systems in ihren Anwendungen dienen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Finanzierung durch einen DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) und NIH-Auszeichnungen (R21RAI149161A, DP2AI152071) an O.S.A. unterstützt.
100% Grape Juice | Welch Foods Inc. | N/A | |
Active Dry Yeast (908g) | Red Star Yeast Company, LLC | N/A | |
DMC4500 color camera | Leica Microsystems | DMC4500 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
GAL4-GMR flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 29967 | |
GAL4-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 44373 | |
Glomax 20/20 Luminometer | Promega | E5331 | |
Illumina HiSeq2500 Sequencer | Illumina, Inc. | HiSeq2500 | |
M165FC fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | M165FC | |
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer | ThermoFisher | NDONEC-W | |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit | New England Biolabs, Inc. | E7770 | |
plasmid # 112686 | Addgene | 112686 | |
plasmid # 112688 | Addgene | 112688 | |
plasmid # 132416 | Addgene | 132416 | |
plasmid # 132417 | Addgene | 132417 | |
plasmid # 132419 | Addgene | 132419 | |
plasmid # 132420 | Addgene | 132420 | |
plasmid # 132421 | Addgene | 132421 | |
plasmid # 132422 | Addgene | 132422 | |
plasmid # 132425 | Addgene | 132425 | |
plasmid # 132426 | Addgene | 132426 | |
plasmid # 133304 | Addgene | 133304 | |
plasmid # 164586 | Addgene | 164586 | |
plasmid #132418 | Addgene | 132418 | |
plasmid pJFRC81 | Addgene | 36432 | |
Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Restriction endonucleases AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | |
Restriction endonucleases NotI | New England Biolabs Inc. | R0189L | |
Restriction endonucleases PacI | New England Biolabs Inc. | R0547L | |
Restriction endonucleases PstI | New England Biolabs Inc. | R0140L | |
Restriction endonucleases SwaI | New England Biolabs Inc. | R0604L | |
Restriction endonucleases XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145L | |
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Turbo DNase | Invitrogen | AM2238 | |
U6-3:4-gRNA-Fluc flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84125 | |
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84986 | |
U6-3:4-gRNA-N flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84122 | |
U6-3:4-gRNA-w flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84124 | |
U6-3:4-gRNA-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84123 | |
UASt-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84121 | |
UASt-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84120 | |
Ubiq-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84118 | |
Ubiq-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84119 | |
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84127 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits | Zymo Research Corporation | D4007 |