מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש באנזים Cas13D הממוקד ברנ”א (RfxCas13D) בזבובים.
CasRx, חברה במשפחת Cas13 הממוקדת ברנ”א, היא תוספת חדשה ומבטיחה של טכנולוגיות CRISPR/Cas בהפחתת תמליל גנים יעילה עם פרופיל אטרקטיבי מחוץ למטרה הן ברמה התאית והן ברמה האורגנית. לאחרונה דווח כי מערכת CRISPR/CasRx יכולה לשמש להשגת הפחתת תעתיק גנים בכל מקום ורקמות ספציפית לדרוסופיל מלנוגאסטר. מאמר זה מפרט את השיטות מהעבודה האחרונה, המורכבת משלושה חלקים: 1) בכל מקום ב- vivo אנדוגני RNA פילוח באמצעות מערכת CasRx שני רכיבים; 2) בכל מקום ב- vivo אקסוגני RNA מיקוד באמצעות מערכת CasRx שלושה רכיבים; ו-3) פילוח RNA ספציפי לרקמות באמצעות מערכת CasRx בעלת שלושה רכיבים. ההשפעות של פילוח RNA שנצפו כוללות שינויים פנוטיפיים ספציפיים לגנים ממוקדים, הפחתת תעתיק RNA ממוקדת, ופנוטיפים קטלניים מדי פעם הקשורים לביטוי גבוה של חלבון CasRx ופעילות נלווית. בסך הכל, תוצאות אלה הראו כי מערכת CasRx מסוגלת למקד הפחתת תעתיק RNA ברמה האורגנית באופן ניתן לתכנות ויעיל, המוכיח כי ב- vivo transcriptome פילוח, והנדסה היא אפשרית ומניחה את הבסיס לטכנולוגיות פילוח RNA מבוססות VIVO CRISPR.
מאז הופעתן של טכנולוגיות פלינדרומיות קצרות (CRISPR), רוב המיקוד בתחום זה היה בעריכת דנ”א, המציע יישומים טרנספורמטיביים ברפואה וביוטכנולוגיה1. שינוי קבוע של רצפי DNA, עם זאת, לא תמיד רצוי משיקולים אתיים. לאור זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה החלו לפתח כלים מבוססי CRISPR למיקוד RNA והוכיחו כי אכן ניתן להשתמש בטכנולוגיות CRISPR למיקוד RNA במגוון מערכות ביולוגיות2,3,4,5,6,7. ברבות מהמערכות הללו שנבדקו, הגישה הנפוצה כיום למיקוד RNA והפחתת תמלילים היא הפרעות RNA (RNAi), אשר רחוק מלהיות מושלם, לעתים קרובות מציג יעילות מגוונת ופעילות גבוהה מחוץ למטרה כאשר נעשה שימוש vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . לכן, בהתחשב במצב של טכנולוגיות אלה, כדאי לבחון עוד יותר את הפוטנציאלים של כלים מבוססי CRISPR עבור פילוח RNA.
מחקר אחד בולט שנערך לאחרונה דיווח כי ריבונוקלאז CasRx, חבר בכיתת Cas13d, יכול להפחית ביעילות את רמות תעתיק הגנים בתרבות התאים האנושיים ובעל פרופיל אטרקטיבי מחוץ למטרה4. ממצא זה הוביל לשאלה אם ריבונוקלאז חדש זה יכול לשמור על יעילותו ושיעור נמוך מחוץ למטרה עבור RNA מיקוד ברמה האורגנית. מחקר שנערך לאחרונה התייחס לשאלה זו על ידי מראה כי מערכת CasRx ניתן להשתמש כדי להשיג בכל מקום ורקמות ספציפי תעתיק תעתיק Drosophila melanogaster5.
כדי לייעל את השימושיות של גישה זו שפורסמה לאחרונה, פרוטוקול זה מפרט את השיטות מעבודה זו לאחרונה, המורכבת משלושה חלקים עיקריים: 1) הנמצאים בכל מקום במיקוד RNA של vivo באמצעות מערכת CasRx בעלת שני רכיבים; 2) בכל מקום ב- vivo אקסוגני RNA מיקוד באמצעות מערכת CasRx שלושה רכיבים; ו-3) פילוח RNA ספציפי לרקמות באמצעות מערכת CasRx בעלת שלושה רכיבים.
מדריך RNAs (gRNA) מיקוד גנים יעד שונים תחת שליטתו של מקדם בכל מקום תוכננו וקווי זבוב המבטאים מבנים המכילים gRNA אלה נוצרו. מבנים CasRx תחת שליטתו של מקדם בכל מקום, או מקדם רצף הפעלה במעלה הזרם מותנה (UASt) הניתן להפעלה על ידי גורם התמלול GAL4, תוכננו גם הם וקווים מעופפים המטפחים מבנים המכילים CasRx אלה שנוצרו. מבנים CasRx לא פעילים קטליטית, dCasRx, תוכננו ושימשו כפקדים שליליים. RNA בכל מקום מיקוד זבובים מושגת על ידי חציית קווי זבובים ביטוי gRNA עם קווי זבובים בכל מקום CasRx ביטוי. האבן המבטאת הן את מבנה ה- gRNA המתמקד בתעתיק גנים מסוים והן בחלבון CasRx יש הפחתה בכל מקום של תמלילי גנים ממוקדים. RNA ספציפי לרקמות הממוקד בזבובים מושג על ידי חציית זבובים הראשונים המביעים GRNA עם UASt-CasRx המבטאים זבובים, המשיגים זבובים טרנסהטרוזיגוס הנושאים מבנים GRNA ו- UASt-CasRx. זבובים כאלה בתורם חוצים עם זבובים ספציפיים לרקמות GAL4 ביטוי, וכתוצאה מכך ייצור של ביטוי CasRx ספציפי לרקמות ומיקוד RNA בזבובים.
האופי הניתן לתכנות של מערכת CasRx מציע אפשרות להתאמה אישית ואופטימיזציה כדי לסייע בהשגת יעילות גבוהה ופעילות נמוכה מחוץ ליעד עבור פילוח RNA של vivo. יישומים פוטנציאליים של פילוח RNA מבוסס CRISPR הם רבים, כולל החלפת RNAi במעבדה ותרומת בקרת וקטור חרקים בטבע. של האחרון, אחד הצרכים העולמיים ללא מענה הוא פיתוח כלים יעילים כדי להילחם בזיהומים של וירוסי RNA המועברים באמצעות יתושים. נגיפי RNA רבים, כגון דנגי, זיקה ווירוס צ’יקונגוניה, מועברים באמצעות יתושים, המשפיעים על בריאות האדם ותורמת לתמותה. הצעות רבות להנדסת אוכלוסיות יתושים עם עמידות לנגיף למניעת מחלות הובאו; עם זאת, אף טכנולוגיה נוכחית אינה מסוגלת להפוך יתושים לעמידים בו זמנית בפני כל נגיפי ה- RNA המשמעותיים18,19,20,21,22,23. מערכות Cas המיועדות ל-RNA עשויות לספק נקודת התחלה לטכנולוגיה כזו על-ידי הפעלת פלטפורמה ניתנת לתכנות למיקוד כל נגיפי הרנ”א המועברים על ידי יתושים.
עם שלושה עיצובי יישומים שונים של מערכת CasRx, עבודה זו הדגימה RNA לתכנות vivoprogramming בזבובים. האסטרטגיות השונות מספקות צרכי פרויקט שונים, כגון פילוח גנים אנדוגני לעומת אקסוגני ומיקוד RNA בכל מקום לעומת פילוח RNA ספציפי לרקמות. ההשפעות של פילוח RNA כללו שינויים פנוטיפיים ספציפיים לגן היעד, הפחתת תעתיק RNA היעד, ופנוטיפים קטלניות מדי פעם הקשורים לביטוי גבוה של חלבון CasRx ופעילות נלווית. בסך הכל, תוצאות אלה הראו כי מערכת CasRx מסוגלת למקד הפחתת תעתיק RNA ברמה האורגנית באופן ניתן לתכנות ויעיל.
אחד הגורמים העיקריים להתאמה אישית מוצלחת של מערכת CasRx הוא העיצוב של gRNAs. באופן ספציפי, העצה הבאה תהיה לשים לב: רצף היעד הוא סביב 30 נוקלאוטידים באורך, אורך מתיחות poly-U ברצף היעד הוא 4 זוגות בסיס או פחות, תוכן GC רצף היעד הוא בטווח של 30% – 70%, רצף היעד אינו צפוי ליצור מבני סיכת ראש RNA חזקים, ואת רצף היעד מכיל מבנה RNA משני או שלשלני חזוי מינימלי5.
בנוסף לתכנוני ה-gRNA, שלב הגנטיקה של הזבוב בכל פרוטוקול הוא קריטי גם ביישום מוצלח. נוכחות או היעדר פנוטיפים מוגדרים שהועברו מההורים בצאצאים חשובים לזיהוי וכימות פנוטיפים הנגרמים על ידי מערכת CasRx בצאצאי transheterozygous. כמו כן, הגדרת צלבי בקרה באמצעות זבובי dCasRx במקביל מועילים גם לפנוטיפים לא ספציפיים בצאצאי transheterozygous.
ראוי לציין כי תוצאות אלה חשפו בעיית רעילות שהוצגה על ידי הבעת CasRx וחלבון dCasRx בכל מקום בזבוב, מגבלה של מערכת CasRx. ביטוי בכל מקום של CasRx או dCasRx תחת מקדם Ubiq לבד, ללא gRNAs, הגיע עם עלויות כושר לא טריוויאלי, כמו לא זבובי Ubiq-CasRx ולא זבובי Ubiq-dCasRx יכול להיות מבוסס כמו קווי הומוזיגוס. להיפך, UASt-CasRx ו UASt-dCasRx זבובים ניתן לבסס כמו מניות הומוזיגוס בריא, אם כי בשל העיצוב של ערכת הצלב הם נשמרו כמו מלאי מאוזן כפול, עובדה התומכת בקיומה של רעילות הנגרמת על ידי ביטוי חלבון CasRx בכל מקום. ראיה תומכת נוספת היא כי בניסויי בקרה מעורבים dCasRx, אשר אינו פעיל מבחינה קטליטית, אחוזי הזבובים הנושאים הן dCasRx והן gRNA מבנים מתוך המספר הכולל של זבובים בדור F1 היו נמוכים בעקביות מ -50%, היחס הצפוי בהתבסס על גנטיקה מנדליאנית אם לא היה קיים רעילות הקשורה ל- dCasRx. זה הצביע על כך בכל מקום להביע dCasRx, יחד עם gRNAs, גורמים רעילות בזבוב, וכתוצאה מכך יחס ירושה פחות מהצפוי. יחסי הירושה של transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, זבובי GAL4 עקבו אחר הגנטיקה המנדליאנית, אשר שוב מרמז על הרעילות הנגרמת במיוחד על ידי ביטוי בכל מקום של חלבוני CasRx ו- dCasRx. רעילות במערכת CRISPR/Cas אינה חדשה. כמויות גבוהות של חלבון Cas9 הוכח להיות רעיל במספר אורגניזמים, כולל זבובים 29,30,31,32. מחקר שנערך לאחרונה פיתח מערכת GAL4/UAS מותאמת אישית שיכולה לכוונן את כמות חלבון Cas9 המתבטאת בזבובים על ידי הוספת מסגרת קריאה פתוחה באורך משתנה בין רצף UAS לבין רצף Cas9 במבנה UAS-Cas933. לכן, כדאי לבחון דרכים להפחית רעילות הנגרמת על ידי CasRx על ידי כוונון רמת ביטוי חלבון CasRx.
מלבד הרעילות הנגרמת על ידי ביטוי בכל מקום של חלבוני CasRx ו- dCasRx, התוצאות הראו גם קטלניות הקשורה לאפקטים החוץ ספציפיים של מערכת CasRx, תכונה של מערכות CRISPR רבות1,2,7,34. בחלק מהזבובים CasRx ו- gRNA הגן הלא חיוני מבטאים זבובים כפולים או משולשים transheterozygous, למשל בעת מיקוד Notch, זבובי Transheterozygous CasRx יש רמות נמוכות משמעותית של שיעור הישרדות לעומת זבובי dCasRx transheterozgyous. בניתוח RNA-seq של זבובי הטרנסה-טרנס-ארק אלה ומבטאי gRNA, נצפו הן הפחתת רמות תעתיק גן היעד והן הפחתת תמלילי גנים שאינם מטרה. השפעות נלוות אלה היו תלויות CasRx ותלויות מטרה, שכן הן נצפו רק בזבובי טרנסהטרוזיגוס המבטאות הן את חלבון ה- CasRx והן את ה- gRNA. ראוי לציין כי אחד הגנים היעד, לבן, הראה רק ירידה מוגבלת, לא סטטיסטית משמעותית בתעתיקים כאשר הגן הלבן היה ממוקד על ידי CasRx, אשר היה בניגוד פנוטיפ הפחתת פיגמנט ברור. ההשערה היא כי ייתכן שהסיבה לכך היא ש- 1) התזמון של איסוף מדגם RNA-seq לא היה מיושר היטב עם התזמון כאשר הגן הלבן מגיע לביטוי השיא שלו במהלך ההתפתחות המוקדמת, ו -2) הביטוי המקומי של הגן הלבן בעיניים הופך אותו למאתגר לאסוף את הרקמות הרלוונטיות בשלב הפיתוח המוקדם כאשר רק איסוף מדגם של כל הגוף הוא אפשרי. כדי להפחית את הפעילות המשנית במערכת CasRx, מחקרים עתידיים נקראים להבין באופן מלא את המנגנונים שבבסיס מערכת התופעה מחוץ למטרה ברמה האורגנית.
מעניין, מחקר שנערך לאחרונה35 המתאר כלי Cas13 ממוקדי RNA בזבובים נראה כדי לשפר את הרעילות הכללית הקשורה ביטוי CasRx, מכמה סיבות אפשריות. ראשית, המחברים מקודדים מחדש את הטרנסג’נס Cas13 כדי לייעל את הביטוי בדרוסופילה והשתמשו במקדם חלש יותר (actin 5C) בהשוואה למקדם היוביקוויטין המשמש במחקר הנוכחי, מה שהוביל ככל הנראה לרמות נמוכות יותר של ביטוי Cas13 ובכך פחות רעילות. ואכן, זה נתמך על ידי התצפיות כי UAST מונע CasRx וביטוי dCasRx לא היה, כשלעצמו, רעיל, כמו מחקר זה (ואת המחברים ב 35) לא הבחין כל קטלניות ברורה זבובים UASt-CasRx. יתר על כן, מחברים אלה מקודדים gRNAs שלהם באופן שונה בהשוואה למחקר זה, אשר עשוי להשפיע על הביטוי שלהם והפחית את הרעילות של המערכת זבובי transheterozygous Cas13/gRNA. לדוגמה, במחקר שלהם שני gRNAs באו לידי ביטוי באמצעות מקדם U6:3 ומאוגף על ידי tRNAs כדי לאפשר עיבוד gRNA על התבגרות tRNA ללא צורך CasRx35. לעומת זאת, במחקר זה, gRNAs קודדו כערכים המתמקדים עד 4 מיקומים לכל גן ומחקים את מבנה מערך Cas13 אנדוגני שנמצא בחיידקים, אשר דורש את האנזים Cas13 לעבד כל gRNA. גישות שונות אלה עשויות להוביל להבדלים ברמות ביטוי gRNA וגורמים אחרים שעשויים להיות להם השפעות מובנות על הרעילות של המערכת כולה. לבסוף, Huynh ואח ‘ ממוקד גנים שונים מאלה ממוקדים במחקר הנוכחי, אשר לגרום הבדלים באינטראקציה היעד-Cas / gRNA ופעילות בטחונות ועשויים להיות השפעות על רמות הנצפות של קטלניות. הבדלים אלה ברעילות שנצפתה מצדיקים חקירה נוספת כדי לזהות דרכים שבהן ניתן לשפר את המערכות הכוללות.
בסך הכל, מחקר זה הוא ההדגמה הראשונה של מערכת Cas ממוקדת גנטית פונקציונלית לתכנות ב- D. melanogaster, אם כי אופטימיזציה נוספת של מערכת CasRx (בהתאם למה שדווח35) תידרש להפחית עוד יותר את הקטלניות הקשורה למטרה ולהגדיל את היעילות של מחשוף CasRx על היעד. פילוח RNA עם אנזימי Cas הוא תחום המתפתח במהירות עם יישומים פוטנציאליים רבים החל בקרה וקטור חרקים לשימושים טיפוליים1,2,3,4,5,6,7, ופרוטוקול זה מציע חבילת התחלה לכל מי שמעוניין לעצב את מערכת CasRx הראשונה שלהם בזבובים, תוך התאמה להתאמה אישית ואופטימיזציה נוספת של המערכת. הדוגמאות המוצגות כאן מדגימים מגוון תוצאות שניתן להיתקל בהן במהלך יישום מערכת זו ב- vivo ועשויות לשמש אמות מידה עבור משתמשים אחרים בהערכת הביצועים של מערכת CasRx ביישומים שלהם.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מענק תוכנית הגנים הבטוחים של DARPA (HR0011-17-2-0047), ופרסים של NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) שהוענק ל- O.S.A.
100% Grape Juice | Welch Foods Inc. | N/A | |
Active Dry Yeast (908g) | Red Star Yeast Company, LLC | N/A | |
DMC4500 color camera | Leica Microsystems | DMC4500 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
GAL4-GMR flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 29967 | |
GAL4-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 44373 | |
Glomax 20/20 Luminometer | Promega | E5331 | |
Illumina HiSeq2500 Sequencer | Illumina, Inc. | HiSeq2500 | |
M165FC fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | M165FC | |
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer | ThermoFisher | NDONEC-W | |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit | New England Biolabs, Inc. | E7770 | |
plasmid # 112686 | Addgene | 112686 | |
plasmid # 112688 | Addgene | 112688 | |
plasmid # 132416 | Addgene | 132416 | |
plasmid # 132417 | Addgene | 132417 | |
plasmid # 132419 | Addgene | 132419 | |
plasmid # 132420 | Addgene | 132420 | |
plasmid # 132421 | Addgene | 132421 | |
plasmid # 132422 | Addgene | 132422 | |
plasmid # 132425 | Addgene | 132425 | |
plasmid # 132426 | Addgene | 132426 | |
plasmid # 133304 | Addgene | 133304 | |
plasmid # 164586 | Addgene | 164586 | |
plasmid #132418 | Addgene | 132418 | |
plasmid pJFRC81 | Addgene | 36432 | |
Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Restriction endonucleases AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | |
Restriction endonucleases NotI | New England Biolabs Inc. | R0189L | |
Restriction endonucleases PacI | New England Biolabs Inc. | R0547L | |
Restriction endonucleases PstI | New England Biolabs Inc. | R0140L | |
Restriction endonucleases SwaI | New England Biolabs Inc. | R0604L | |
Restriction endonucleases XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145L | |
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Turbo DNase | Invitrogen | AM2238 | |
U6-3:4-gRNA-Fluc flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84125 | |
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84986 | |
U6-3:4-gRNA-N flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84122 | |
U6-3:4-gRNA-w flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84124 | |
U6-3:4-gRNA-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84123 | |
UASt-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84121 | |
UASt-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84120 | |
Ubiq-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84118 | |
Ubiq-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84119 | |
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84127 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits | Zymo Research Corporation | D4007 |