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Imunologia e Infecção

CRISPR/CasRx का उपयोग करके ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सर्वव्यापी और ऊतक-विशिष्ट आरएनए लक्ष्यीकरण

Published: February 05, 2021
doi:
10.3791/62154
, , , ,
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology,University of California

Summary

यह आलेख मक्खियों में आरएनए-लक्ष्यीकरण Cas13D एंजाइम (RfxCas13D) का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है।

Abstract

CasRx, आरएनए-लक्ष्यीकरण Cas13 परिवार का एक सदस्य, सेलुलर और जीव दोनों स्तरों पर एक आकर्षक ऑफ-टारगेट प्रोफ़ाइल के साथ कुशल जीन प्रतिलेख कमी में CRISPR / Cas प्रौद्योगिकियों का एक आशाजनक नया जोड़ है। यह हाल ही में बताया गया है कि CRISPR / CasRx प्रणाली का उपयोग ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सर्वव्यापी और ऊतक-विशिष्ट जीन प्रतिलेख कमी को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। यह पेपर हाल के काम से विधियों का विवरण देता है, जिसमें तीन भाग शामिल हैं: 1) दो-घटक CasRx सिस्टम का उपयोग करके विवो अंतर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी; 2) एक तीन घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी; और 3) ऊतक-विशिष्ट विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में एक तीन-घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर लक्ष्यीकरण. देखे गए आरएनए लक्ष्यीकरण के प्रभावों में लक्षित जीन विशिष्ट फेनोटाइपिक परिवर्तन, लक्षित आरएनए प्रतिलेख में कमी, और कभी-कभी घातकता फेनोटाइप शामिल हैं जो कैसरक्स प्रोटीन और संपार्श्विक गतिविधि की उच्च अभिव्यक्ति से जुड़े होते हैं। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चला है कि CasRx प्रणाली एक प्रोग्राम योग्य और कुशल तरीके से जीव स्तर पर आरएनए प्रतिलेख में कमी को लक्षित करने में सक्षम है, यह दर्शाता है कि विवो ट्रांसक्रिप्टोम लक्ष्यीकरण में, और इंजीनियरिंग व्यवहार्य है और विवो CRISPR-आधारित आरएनए लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकियों में भविष्य के लिए नींव रखता है।

Introduction

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) प्रौद्योगिकियों के आगमन के बाद से, इस क्षेत्र में अधिकांश ध्यान डीएनए संपादन पर रहा है, जो चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी में परिवर्तनकारी अनुप्रयोग प्रदान करता है1। डीएनए अनुक्रमों का स्थायी परिवर्तन, हालांकि, नैतिक विचारों के कारण हमेशा वांछित नहीं होता है। इसके प्रकाश में, हाल के अध्ययनों ने आरएनए को लक्षित करने के लिए CRISPR-आधारित उपकरण विकसित करना शुरू कर दिया और दिखाया कि CRISPR प्रौद्योगिकियों का उपयोग वास्तव में विभिन्न प्रकार के जैविक प्रणालियों में आरएनए-लक्ष्यीकरण के लिए किया जा सकता है2,3,4,5,6,7। परीक्षण किए गए इन प्रणालियों में से कई में, आरएनए और ट्रांसक्रिप्ट में कमी को लक्षित करने के लिए वर्तमान व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) है, जो सही से बहुत दूर है, अक्सर विवो 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 में उपयोग किए जाने पर विभिन्न प्रभावकारिता और उच्च ऑफ-टारगेट गतिविधि का प्रदर्शन करता है। . इसलिए, इन प्रौद्योगिकियों की स्थिति को देखते हुए, यह आरएनए लक्ष्यीकरण के लिए CRISPR-आधारित उपकरणों की क्षमताओं की खोज करने के लायक है।

एक उल्लेखनीय हाल के अध्ययन ने बताया कि राइबोन्यूक्लिएज CasRx, Cas13d वर्ग का एक सदस्य, मानव सेल संस्कृति में जीन प्रतिलेख के स्तर को कुशलतापूर्वक कम कर सकता है और एक आकर्षक ऑफ-टारगेट प्रोफाइल 4 के पास है। इस खोज ने इस सवाल को जन्म दिया कि क्या यह नया राइबोन्यूक्लिएज जीव स्तर पर आरएनए लक्ष्यीकरण के लिए अपनी प्रभावकारिता और कम ऑफ-टारगेट दर को बनाए रख सकता है। हाल के एक अध्ययन ने इस प्रश्न को संबोधित करते हुए दिखाया कि कैसरक्स प्रणाली का उपयोग ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 5 में सर्वव्यापी और ऊतक-विशिष्ट जीन ट्रांसक्रिप्ट कमी को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

इस हाल ही में प्रकाशित दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को सुव्यवस्थित करने के लिए, यह प्रोटोकॉल इस हाल के काम से विधियों का विवरण देता है, जिसमें तीन मुख्य भाग होते हैं: 1) दो-घटक CasRx सिस्टम का उपयोग करके विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी; 2) एक तीन घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी; और 3) ऊतक-विशिष्ट विवो आरएनए लक्ष्यीकरण एक तीन घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर.

एक सर्वव्यापी प्रमोटर के नियंत्रण में विभिन्न लक्ष्य जीनों को लक्षित करने वाले गाइड आरएनए (जीआरएनए) को डिजाइन किया गया था और इन जीआरएनए-युक्त निर्माणों को व्यक्त करने वाली फ्लाई लाइनों को उत्पन्न किया गया था। CasRx या तो एक सर्वव्यापी प्रमोटर, या एक सशर्त अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम (UASt) प्रमोटर GAL4 प्रतिलेखन कारक द्वारा सक्रिय करने योग्य के नियंत्रण में निर्माण करता है, भी डिजाइन किया गया था और इन CasRx युक्त निर्माणों उत्पन्न harboring लाइनों उड़ान भरने. Catalytically निष्क्रिय CasRx constructs, dCasRx, डिज़ाइन किए गए थे और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए गए थे। मक्खियों में सर्वव्यापी आरएनए लक्ष्यीकरण सर्वव्यापी CasRx-व्यक्त फ्लाई लाइनों के साथ gRNA-व्यक्त फ्लाई लाइनों को पार करके प्राप्त किया जाता है। दोनों gRNA निर्माण एक विशिष्ट जीन प्रतिलेख और CasRx प्रोटीन को लक्षित करने को व्यक्त करने वाली संतानों में लक्षित जीन टेपों की सर्वव्यापी कमी होती है। मक्खियों में ऊतक-विशिष्ट आरएनए लक्ष्यीकरण पहले जीआरएनए-व्यक्त मक्खियों को पार करके प्राप्त किया जाता है, जिसमें यूएएसटी-कैसरक्स मक्खियों को व्यक्त किया जाता है, जो जीआरएनए और यूएएसटी-कैसरक्स दोनों निर्माणों को ले जाने वाले ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियों को प्राप्त करता है। बदले में इस तरह की मक्खियों को ऊतक-विशिष्ट GAL4-व्यक्त मक्खियों के साथ पार किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक-विशिष्ट CasRx अभिव्यक्ति और मक्खियों में आरएनए-लक्ष्यीकरण की पीढ़ी होती है।

CasRx सिस्टम की प्रोग्राम करने योग्य प्रकृति अनुकूलन और अनुकूलन की संभावना प्रदान करती है ताकि विवो आरएनए लक्ष्यीकरण के लिए उच्च प्रभावकारिता और कम ऑफ-टारगेट गतिविधि प्राप्त करने में मदद मिल सके। CRISPR-आधारित आरएनए-लक्ष्यीकरण के संभावित अनुप्रयोग कई हैं, जिनमें प्रयोगशाला में आरएनएआई को प्रतिस्थापित करना और जंगली में कीट वेक्टर नियंत्रण में योगदान देना शामिल है। उत्तरार्द्ध में से, वैश्विक अपूर्ण आवश्यकताओं में से एक मच्छरों के माध्यम से प्रसारित आरएनए वायरस के संक्रमण का मुकाबला करने के लिए कुशल उपकरणों का विकास है। कई आरएनए वायरस, जैसे डेंगू, जीका और चिकनगुनिया वायरस, मच्छरों के माध्यम से फैलते हैं, मानव स्वास्थ्य को प्रभावित करते हैं, और मृत्यु दर में योगदान देते हैं। रोग की रोकथाम के लिए वायरस प्रतिरोध के साथ इंजीनियरिंग मच्छर आबादी के लिए कई प्रस्ताव किए गए हैं; हालांकि, कोई भी वर्तमान तकनीक मच्छरों को सभी महत्वपूर्ण आरएनए वायरस 18,19,20,21,22,23 के लिए एक साथ प्रतिरोधी बनाने में सक्षम नहीं है। आरएनए-लक्षित कैस सिस्टम सभी मच्छर-जनित आरएनए वायरस को लक्षित करने के लिए एक प्रोग्राम योग्य मंच को सक्षम करके ऐसी तकनीक के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान कर सकता है।

Protocol

1. एक दो घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी Ubiq-CasRx और Ubiq-dCasRx अभिव्यक्ति वेक्टर जनरेट कर रहा है प्राइमर 1050E के साथ एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) का उपयोग करके CasRx अनुक्रम को बढ़ाएँ। C3 और 1050E C4 और मूल CasRx pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx) का निर्माण करते हैं; और प्राइमर 1050E के साथ पीसीआर का उपयोग कर dCasRx अनुक्रम को बढ़ाएं। C3 और 1050E C4 और मूल dCasRx pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (तालिका 1) का निर्माण। जेल-प्रवर्धित CasRx और dCasRx टुकड़े बाद में एक जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग कर शुद्ध. डाइजेस्ट बेस वेक्टर (Addgene plasmid #112686) प्रतिबंध एंजाइमों SwaI और PacI24 के साथ। परिणामी उत्पादों में, बड़े टुकड़े को जेल-शुद्ध करने के लिए एक किट का उपयोग करें, जिसे बेस वेक्टर बैकबोन कहा जाता है। आधार वेक्टर बैकबोन और गिब्सन असेंबली विधि का उपयोग कर CasRx टुकड़ा के साथ Ubiq-CasRx वेक्टर को इकट्ठा; आधार वेक्टर बैकबोन और dCasRx टुकड़ा गिब्सन असेंबली method25 का उपयोग कर के साथ Ubiq-dCasRx वेक्टर को इकट्ठा।नोट:: Addgene ID की Ubiq-CasRx वेक्टर (OA-1050E) #132416 है, और Addgene ID की Ubiq-dCasRx वेक्टर (OA-1050R) #132417 है। gRNA व्यंजक वेक्टर जनरेट कर रहा है निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर प्रत्येक जीआरएनए टुकड़े को डिजाइन करें: लक्ष्य अनुक्रम लंबाई में 30 न्यूक्लियोटाइड्स होने के नाते; लक्ष्य अनुक्रम में पॉली-यू की अधिकतम लंबाई 4 आधार जोड़े होने के कारण फैली हुई है; लक्ष्य अनुक्रम जीसी सामग्री 30% – 70% की सीमा में जा रहा है; लक्ष्य अनुक्रम ने मजबूत आरएनए हेयरपिन संरचनाओं को बनाने की भविष्यवाणी नहीं की; और न्यूनतम अनुमानित आरएनए माध्यमिक या तृतीयक संरचना 5 युक्त लक्ष्य अनुक्रम।नोट: इस अध्ययन ने प्रत्येक gRNA को 4 अग्रानुक्रम अनुक्रमों के रूप में डिज़ाइन किया है, प्रत्येक 30 न्यूक्लियोटाइड लंबे समय तक सीधे दोहराता है, और दोनों सिरों पर 7-थाइमिन टर्मिनेटर के साथ 36 न्यूक्लियोटाइड लंबे समय तक सीधे दोहराता है, और दोनों सिरों पर 7-थाइमिन टर्मिनेटर के साथ। बहिर्जात लक्ष्य जीन, जीएफपी के लिए, ऊपर के समान मानदंड ों का पालन एक OpIE2-GFP fragment5 के अतिरिक्त के साथ किया गया था। प्राइमर 1043.C1 और 1043.C23 और Addgene प्लास्मिड #112688 (तालिका 1)26 के साथ PCR का उपयोग करके U6: 3 प्रमोटर अनुक्रम को बढ़ाएं। जेल-प्रवर्धित U6: 3 टुकड़े जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग कर शुद्ध. पाचन Addgene प्लास्मिड # 112688 प्रतिबंध एंजाइम Asci और XbaI24 के साथ. परिणामी उत्पादों में, बड़े टुकड़ों को जेल-शुद्ध करने के लिए एक किट का उपयोग करें, जिसे प्री-बेस वेक्टर बैकबोन कहा जाता है। गिब्सन असेंबली विधि 25 का उपयोग करके पूर्व-आधार वेक्टर बैकबोन और U6: 3 टुकड़ा के साथ आधार वेक्टर को इकट्ठा करें। इसके बाद बेस वेक्टर को OA-1043 नाम दिया गया है।नोट: प्लास्मिड OA-1043 की Addgene ID # 164586 है। बाहरी जीन संश्लेषण सेवा का उपयोग करके लक्ष्य जीन के जीआरएनए टुकड़े को संश्लेषित करें। प्रतिबंध एंजाइम PstI और NotI24 के साथ आधार वेक्टर OA-1043 को पचाएं। पूरे पाचन उत्पाद को रखें, जिसे पचा हुआ ओए -1043 कहा जाता है। पचाए गए ओए -1043 और लक्ष्य जीन जीआरएनए टुकड़ा गिब्सन असेंबली विधि 25 का उपयोग करके जीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर को इकट्ठा करें।नोट: चार लक्ष्य जीनों का अध्ययन किया गया था: तीन अंतर्जात (सफेद, पायदान, पीला) थे, एक बहिर्जात (जीएफपी) था। उनके Addgene आईडी हैं: # 132420 (gRNAw), # 132421 (gRNAN), # 132425 (gRNAY), और # 133304 (gRNAGFP)। ट्रांसजेनिक मक्खियों का उत्पादन बाहरी मक्खी भ्रूण इंजेक्शन सेवा और ØC31 एकीकरण साइटों युक्त मक्खियों से भ्रूण का उपयोग कर मक्खी भ्रूण में अभिव्यक्ति वैक्टर इंजेक्ट करें। 26 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट किए गए भ्रूण को पीछे करें।नोट: attp40w (2 गुणसूत्र पर एकीकरण साइटों के साथ) लाइन CasRx लाइनों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और 8622 (3 गुणसूत्र पर एकीकरण साइटों के साथ) लाइन का उपयोग विभिन्न gRNA लाइनों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। मक्खियों को या तो समयुग्मज रेखाओं के रूप में या संतुलित विषमयुग्मजी रेखाओं के रूप में रखें।नोट: Ubiq-CasRx और Ubiq-dCasRx मक्खियों को बैलेंसर के रूप में CyO के साथ विषमयुग्मजी संतुलित लाइनों के रूप में रखा गया था। इसके अलावा, दोनों Ubiq-CasRx और Ubiq-dCasRx वैक्टर एक dsRed मार्कर होते हैं। नतीजतन, Ubiq-CasRx और Ubiq-dCasRx मक्खियों में निम्नलिखित तीन फेनोटाइप होते हैं: dsRed-positive, घुंघराले पंख, और सफेद आंखें। जीआरएनए-व्यक्त मक्खियों को होमोजीगस लाइनों के रूप में रखा गया था। उनके ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (BDSC) फ्लाई स्टॉक नंबर हैं: # 84118 (Ubiq-CasRx), # 84119 (Ubiq-dCasRx), # 84124 (gRNAW), # 84122 (gRNAN), # 84123 (gRNAY), # 84986 (gRNAGFP)। फ्लाई जेनेटिक्स (चित्रा 1A) होमोजीगस जीआरएनए लाइन से 10 कुंवारी वयस्क मादा मक्खियों को इकट्ठा करें और संतुलित विषमयुग्मजी यूबिक-कैसरक्स / सीवाईओ लाइन से 5 वयस्क पुरुष मक्खियों को इकट्ठा करें। एकत्र मादा और नर मक्खियों, जिन्हें माता-पिता की मक्खियों कहा जाता है, को सूखी खमीर पाउडर (चित्रा 1 ए) के साथ पूरक एक शीशी में रखो। 3 प्रतिकृति उत्पन्न करने के लिए पिछले चरण को 3 बार दोहराएँ। नियंत्रण समूह के लिए, Ubiq-dCasRx/CyO लाइन का उपयोग करें, जबकि बाकी सब कुछ समान रखते हुए।नोट: भोजन की एक नियमित कांच की शीशी के लिए, 0.1 ग्राम सूखा खमीर पाउडर पर्याप्त है। BDSC के फ्लाई फूड रेसिपी का उपयोग किया जाता है। 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली शीशियों को पीछे करें। फिर हर शीशी से सभी माता-पिता की मक्खियों को हटा दें। फिर शीशियों को कम से कम 20 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें। यह देखने के लिए हर दिन शीशियों का निरीक्षण करें कि क्या कोई नई वयस्क संतानें F1 पीढ़ी के प्यूपे से उभरी हैं। यदि हां, तो फ्लाई शीशियों के अंदर कार्बन डाइऑक्साइड टैंक से जुड़ी एक ट्यूब डालकर कार्बन डाइऑक्साइड के साथ उन्हें बेहोश करें, फिर प्रवाह स्विच को 10 सेकंड के लिए चालू करें। एक बार जब मक्खियां स्थिर हो जाती हैं, तो उन्हें शीशी से फ्लाई-पैड पर खाली कर दें, जो कार्बन डाइऑक्साइड टैंक से भी जुड़ा होता है और कार्बन डाइऑक्साइड लगातार फ्लाई पैड के माध्यम से बाहर निकलता है। anesthetized मक्खियों ‘फेनोटाइप स्कोर और उन्हें एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से जुड़े रंग कैमरे का उपयोग कर छवि. विभिन्न फेनोटाइप्स के साथ संतानों की संख्या की गणना करें। छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग और संकलन (चित्रा 2A – 2D) के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।नोट: मेंडेलियन आनुवांशिकी के आधार पर, प्रत्येक क्रॉस (चित्रा 1 ए) के लिए संतानों के बीच दो प्रकार की मक्खियों की उम्मीद की जाती है। RNA-Seq (चित्र 2E – 2G)नमूना संग्रहनोट:: नीचे दिए गए 3 उदाहरणों में से एक उपयुक्त नमूना संग्रह विधि चुनें; प्रत्येक अलग नमूना प्रकार के लिए 3 प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है।वयस्क मक्खी सिर नमूना संग्रह 10 कुंवारी वयस्क महिला homozygous gRNA लाइन से मक्खियों ले लीजिए. संतुलित विषमयुग्मजी Ubiq-CasRx / CyO लाइन से 5 वयस्क पुरुष मक्खियों ले लीजिए। एकत्र मादा और नर मक्खियों, जो माता-पिता की मक्खियों हैं, को सूखी खमीर पाउडर के साथ पूरक एक शीशी में रखो। 3 प्रतिकृतियों के लिए पिछले चरण को 3 बार दोहराएँ। नियंत्रण समूह के लिए, Ubiq-dCasRx/CyO लाइन का उपयोग करें, जबकि बाकी सब कुछ समान रखते हुए। 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली शीशियों को पीछे करें। फिर हर शीशी से सभी माता-पिता की मक्खियों को हटा दें। फिर शीशियों को 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि संतानें प्यूपे से उभर न जाएं। सही फेनोटाइप के साथ 10 1-दिन पुरानी वयस्क मक्खियों को इकट्ठा करें। कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मक्खियों को एनेस्थेटिक करें, फिर फ्लाई हेड को काट दें और सिर को सूखी बर्फ पर 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब स्टोर करें। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। 17 – 20 घंटे पुराना भ्रूण नमूना संग्रह 8-10 कुंवारी वयस्क महिला homozygous gRNA लाइन से मक्खियों ले लीजिए. संतुलित विषमयुग्मजी Ubiq-CasRx / CyO लाइन से 4-5 वयस्क पुरुष मक्खियों ले लीजिए। एकत्र मादा और नर मक्खियों, जो माता-पिता की मक्खियों हैं, को सूखी खमीर पाउडर के साथ पूरक एक शीशी में रखो। 3 प्रतिकृतियों के लिए पिछले चरण को 3 बार दोहराएँ। नियंत्रण समूह के लिए, Ubiq-dCasRx/CyO लाइन का उपयोग करें, जबकि बाकी सब कुछ समान रखते हुए। 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली शीशियों को पीछे करें। इस नुस्खा के बाद प्रत्येक प्रतिकृति के लिए एक अंगूर-रस भ्रूण संग्रह कक्ष तैयार करें: 376 मिलीलीटर पानी, 126 मिलीलीटर अंगूर का रस, 15 ग्राम आगर, और 6 ग्राम सुक्रोज। एक 1 एल बीकर में मीडिया रखो और यह 5-6 मिनट के लिए उच्च पर माइक्रोवेव करें, जबकि बीकर में मीडिया पर करीबी नजर रखते हुए यह जांचने के लिए कि बुलबुले / फोम दिखाई देते हैं या नहीं। यदि हां, तो माइक्रोवेव को रोकें और बुलबुले / फोम को बसने दें। इस तरह से माइक्रोवेविंग जारी रखें जब तक कि बुलबुला स्पष्ट न हो जाए। जब तक सभी बुलबुले स्पष्ट न हों तब तक घुमाएं नहीं। अंत में, 100% अल्कोहल के 10 मिलीलीटर और एसिटिक एसिड के 5 मिलीलीटर जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण, तो एक 25 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 35 मिमी पेट्री व्यंजन में मीडिया pipet. जब मीडिया पेट्री डिश में जम जाता है, तो यह उपयोग के लिए तैयार होता है। 48 घंटे के इनक्यूबेशन के अंत में, माता-पिता की मक्खियों को अंगूर-रस भ्रूण संग्रह कक्षों में स्थानांतरित करें और उन्हें 3 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर वयस्क मक्खियों को हटा दें, जबकि ताजा रखे गए भ्रूण को अंगूर-रस प्लेटों पर 26 डिग्री सेल्सियस पर एक और 17 घंटे के लिए रखें। इनक्यूबेशन बाद, अंगूर के रस की प्लेटों से 50 – 100 भ्रूण एकत्र करें, उन्हें विआयनीकृत पानी में डुबोकर भ्रूण की सतह को साफ करें, फिर उन्हें बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। पहला इंस्टार लार्वा नमूना संग्रह 8-10 कुंवारी वयस्क महिला homozygous gRNA लाइन से मक्खियों ले लीजिए. संतुलित विषमयुग्मजी Ubiq-CasRx / CyO लाइन से 4-5 वयस्क पुरुष मक्खियों ले लीजिए। एकत्र मादा और नर मक्खियों, जो माता-पिता की मक्खियों हैं, को सूखी खमीर पाउडर के साथ पूरक एक शीशी में रखो। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। नियंत्रण समूह के लिए, Ubiq-dCasRx/CyO लाइन का उपयोग करें, जबकि बाकी सब कुछ समान रखते हुए। 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली शीशियों को पीछे करें। फिर वयस्क मक्खियों को रात भर के लिए एक और नए नियमित भोजन की शीशी में स्थानांतरित करें इनक्यूबेशन (16 ज) 26 डिग्री सेल्सियस पर। फिर, वयस्क मक्खियों को हटा दें। भ्रूण युक्त शीशी को 24 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें, फिर आधारित अलग-अलग मार्करों का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के नीचे ट्रांसहेटेरोज़िगस पहले इनस्टार लार्वा को स्कोर करें। सही फेनोटाइप के साथ 15-30 लार्वा एकत्र करें और उन्हें 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। अनुक्रमण आरएनए निष्कर्षण: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें और सभी नमूनों को संसाधित करने के लिए किट के निर्देश का पालन करें। फिर, निकाले गए आरएनए नमूनों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिएज के साथ इनक्यूबेट करें और नमूनों से किसी भी दूषित डीएनए को हटाने के लिए इसके निर्देश का पालन करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए अखंडता परख सेटअप का उपयोग कर नमूनों में आरएनए अखंडता को मापें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके आरएनए-सेक पुस्तकालयों का निर्माण करें। निम्न सेटिंग्स के साथ लायब्रेरी अनुक्रमण के लिए बाह्य अनुक्रमण सेवा का उपयोग करें: एकल पठन मोड; पढ़ें लंबाई: 50nt, गहराई: 20 लाख प्रति पुस्तकालय पढ़ता है. RTA 1.18.64 के साथ बेस कॉल निष्पादित करें और उसके बाद bcl2fastq 1.8.4 का उपयोग कर FASTQ करने के लिए डेटा कनवर्ट करें।नोट:: कच्चे अनुक्रमण डेटा जैव प्रौद्योगिकी सूचना अनुक्रमण पठन संग्रह के लिए राष्ट्रीय केंद्र में पाया जा सकता है (सबमिशन ID: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]). जैव सूचना विज्ञान मानचित्र अनुक्रमण डेटा से बर्कले ड्रोसोफिला जीनोम प्रोजेक्ट (GenBank परिग्रहण संख्या: GCA_000001215.4) से 6 ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जीनोम जारी करने के लिए पढ़ता है और बहिर्जात CasRx और GFP अनुक्रमों “-outFilterType BySJout” फ़िल्टर विकल्प और “-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster के अलावा STAR aligner28 की डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सेटिंग का उपयोग कर। BDGP6.22.97.gtf “जीन स्थानांतरण प्रारूप फ़ाइल ENSEMBL से. “-t एक्सोन -g gene_id -M -O –fraction” विकल्पों का उपयोग करके सुविधा Counts35 के साथ प्रत्येक एनोटेटेड ट्रांसक्रिप्ट के लिए कच्चे प्रतिलेख की गणना निर्धारित करें. फिर, “addTpmFpkmToFeatureCounts.pl” पर्ल स्क्रिप्ट का उपयोग करके कुल प्रतिलेख गणना का उपयोग करके कच्चे प्रतिलेख गिनती को सामान्य करें। प्रत्येक जीन के टेपों के लॉगरिदमिक फोल्ड परिवर्तन (LFC) का अनुमान लगाने के लिए DESeq2 पाइपलाइन में मूल संकोचन अनुमानक के साथ अधिकतम पश्चवर्ती विधि का उपयोग करें। 2. एक तीन घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी बहिर्जात लक्ष्य सर्वव्यापी अभिव्यक्ति वेक्टर उत्पन्न करना पीसीआर प्राइमर 1052B का उपयोग करके Ubiq प्रमोटर टुकड़ा बढ़ाता है। C1 और 1052B C2 और Addgene प्लास्मिड # 112686 26। फिर, PCR Addgene plasmid #112686 से 908A.1 और 908A.2 (तालिका 1)26 प्राइमरों के साथ प्रवर्धित T2A-eGFP टुकड़े को बढ़ाता है। फिर, PCR प्राइमर 908A.3 और 908A.4 (तालिका 1)26 के साथ Addgene प्लास्मिड #112686 का उपयोग कर उलट अनुक्रम के रूप में Ubiq प्रमोटर टुकड़ा को बढ़ाता है। जेल-Ubiq प्रमोटर टुकड़ा, T2A-eGFP टुकड़ा, और जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग कर उलट Ubiq प्रमोटर टुकड़ा शुद्ध. एक कस्टम firefly लूसिफेरस कोडिंग अनुक्रम और एक कस्टम टुकड़ा जिसमें p10 3’UTR टुकड़ा होता है, एक SV40 3’UTR टुकड़ा के बाद renilla luciferase को उलट दें। पाचन Addgene प्लास्मिड # 112688 प्रतिबंध एंजाइम Asci और XbaI24 के साथ. परिणामी उत्पादों में, जेल-शुद्धिकरण किट का उपयोग करके बड़े टुकड़ों को जेल-शुद्ध करें, जिसे बेस वेक्टर बैकबोन कहा जाता है। आधार वेक्टर बैकबोन और निम्नलिखित टुकड़ों के साथ बेस वेक्टर को इकट्ठा करने के लिए गिब्सन असेंबली विधि का उपयोग करें: Ubiq प्रमोटर टुकड़ा, T2A-eGFP टुकड़ा, उलटा Ubiq प्रमोटर टुकड़ा, firefly luciferase कोडिंग अनुक्रम, और एक SV40 3’UTR fragment25 के बाद उलट रेनिला लूसिफेरस।नोट:: परिणामी दोहरी-luciferase अभिव्यक्ति वेक्टर (OA-1052B) की Addgene ID #132426 है। gRNA व्यंजक वेक्टर जनरेट कर रहा है PCR प्राइमर 1043.C1 और 1043.C23 और Addgene प्लास्मिड #112688 (तालिका 1)26 का उपयोग करके U6: 3 प्रमोटर अनुक्रम को बढ़ाता है। जेल-प्रवर्धित U6: 3 टुकड़े जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग कर शुद्ध. प्रतिबंध एंजाइम Ascii और XbaI24 के साथ Addgene प्लास्मिड # 112688 को पचाने। परिणामी उत्पादों में, जेल-बड़े टुकड़ों को शुद्ध करते हैं, जिसे जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पूर्व-आधार वेक्टर बैकबोन कहा जाता है। गिब्सन असेंबली method25 का उपयोग कर पूर्व-आधार वेक्टर बैकबोन और U6:3 टुकड़ा के साथ आधार वेक्टर इकट्ठा करें। इसके बाद बेस वेक्टर को OA-1043 नाम दिया गया है। बाहरी जीन संश्लेषण सेवा का उपयोग करके लक्ष्य जीन के जीआरएनए टुकड़े को संश्लेषित करें। प्रतिबंध एंजाइम PstI और NotI24 के साथ आधार वेक्टर OA-1043 को पचाएं। पूरे पाचन उत्पाद को रखें, जिसे पचा हुआ ओए -1043 कहा जाता है। पचाए गए ओए -1043 और लक्ष्य जीन जीआरएनए टुकड़ा गिब्सन असेंबली विधि 25 का उपयोग करके जीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर को इकट्ठा करें।नोट: परिणामी प्लास्मिड (OA-1052K) की Addgene ID #132422 है। ट्रांसजेनिक मक्खियों का उत्पादन OA-1052B वेक्टर को फ्लाई भ्रूण में इंजेक्ट करें, जिसमें तीसरे गुणसूत्र पर ØC31 एकीकरण साइट वाली मक्खियों से भ्रूण का उपयोग करके, बाहरी फ्लाई भ्रूण इंजेक्शन सेवा के माध्यम से BDSC फ्लाई स्टॉक नंबर 9744 शामिल हैं। इसी तरह, तीसरे गुणसूत्र, BDSC फ्लाई स्टॉक नंबर 8622 पर ØC31 एकीकरण साइट युक्त मक्खियों से भ्रूण का उपयोग करके फ्लाई भ्रूण में OA-1052K वेक्टर इंजेक्ट करें। 26 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट किए गए भ्रूण को पीछे करें। दोहरी-लूसिफेरस-व्यक्त मक्खियों और जीआरएनए मक्खियों को होमोजीगस लाइनों के रूप में रखें; Ubiq-CasRx लाइनों को डबल-संतुलित विषमयुग्मजी लाइनों के रूप में रखें, जो खंड 1 में उत्पन्न एकल-संतुलित विषमयुग्मजी सर्वव्यापी-CasRx लाइन को पराली (एसटीबी) मार्कर के साथ टीएम 6 बैलेंसर गुणसूत्र ले जाने वाली लाइनों को संतुलित करने के लिए उत्पन्न होती हैं और केवल सफेद आंखों, घुंघराले पंखों और dsRed-फ्लोरोसेंट फेनोटाइप के साथ डबल-संतुलित संतानों को एक साथ बनाए रखती हैं।नोट: BDSC फ्लाई स्टॉक नंबर हैं: # 84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), # 84125 (gRNAFluc)। फ्लाई जेनेटिक्स (चित्रा 1B और चित्रा 3A) दोहरी-लूसिफेरस-व्यक्त लाइन से 8-10 कुंवारी वयस्क मादा मक्खियों को इकट्ठा करें। संतुलित विषमयुग्मजी Ubiq-CasRx / CyO से 4-5 वयस्क पुरुष मक्खियों ले लीजिए; +/TM6, Stb लाइन जो सफेद आंखों, घुंघराले पंखों और dsRed प्रतिदीप्ति को एक साथ दिखाती है। एकत्र मादा और पुरुष मक्खियों को रखें, जो माता-पिता की मक्खियां हैं, सूखी खमीर पाउडर के साथ पूरक एक शीशी में (इसके बाद चरण 1 क्रॉस कहा जाता है)। 3 प्रतिकृतियों के लिए पिछले चरण को 3 बार दोहराएँ। नियंत्रण समूह के लिए, Ubiq-dCasRx/CyO का उपयोग करें; +/TM6, Stb लाइन जबकि सब कुछ एक ही रखने के लिए. 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली चरण 1 क्रॉस शीशियों को पीछे करें। फिर हर शीशी से सभी माता-पिता की मक्खियों को हटा दें। फिर शीशियों को कम से कम 14 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस समय के दौरान, होमोजीगस फायरफ्लाई लूसिफेरस-टार्गेटिंग जीआरएनए लाइन से 8-10 महिला कुंवारियों को इकट्ठा करें। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। हर दिन चरण 1 क्रॉस शीशियों का निरीक्षण करें यह देखने के लिए कि क्या कोई नई वयस्क मक्खी प्यूपे से उभरती है। यदि हां, तो उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एनेस्थेटिक करें, 5 नर मक्खियों को इकट्ठा करें जो Ubiq-CasRx (या Ubiq-dCasRx) और संतानों से दोहरी-लूसिफेरस रिपोर्टर दोनों को व्यक्त करते हैं और उन्हें फायरफ्लाई लूसिफेरस-टार्गेटिंग जीआरएनए लाइन (इसके बाद चरण 2 क्रॉस कहा जाता है) से 10 कुंवारी महिलाओं के साथ एक नई शीशी में डालते हैं। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। एक और 5 एक दिन पुराने पुरुष Ubiq-CasRx (या Ubiq-dCasRx) और चरण 1 क्रॉस शीशियों से दोहरी-लूसिफेरस रिपोर्टर दोनों को व्यक्त करते हुए इकट्ठा करें और उन्हें 26 डिग्री सेल्सियस पर 2 – 4 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, उन्हें 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। तीन प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली चरण 2 क्रॉस शीशियों को पीछे करें। फिर हर शीशी से सभी माता-पिता की मक्खियों को हटा दें। फिर शीशियों को कम से कम 20 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हर दिन चरण 2 क्रॉस शीशियों का निरीक्षण करें यह देखने के लिए कि क्या कोई नई वयस्क संतानपुपे से उभरी है। यदि हां, तो उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एनेस्थेटिकाइज़ करें, एनेस्थेटिक मक्खियों के फेनोटाइप को स्कोर करें और फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से लैस रंग कैमरे का उपयोग करके उन्हें छवि दें। विभिन्न फेनोटाइप्स के साथ संतानों की संख्या की गणना करें। छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग और संकलन के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (चित्रा 3B – 3C)।नोट: मेंडेलियन आनुवांशिकी का सुझाव है कि, यदि मक्खियां सभी व्यवहार्य हैं, तो चरण 2 क्रॉस से संतानों के बीच 4 प्रकार की मक्खियों की उम्मीद की जाती है, प्रत्येक आबादी के 25% के लिए लेखांकन (चित्रा 1 बी और चित्रा 3 ए)। लूसिफेरस परख (चित्रा 3 डी) ट्रिपल transheterozygous मक्खियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण 2.4.1-2.4.5 चरणों को दोहराने से मक्खियों उत्पन्न करें। जन्म के समय नर मक्खियों को इकट्ठा करें और उन्हें 3 दिन की उम्र तक उम्र दें। 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 3 दिन पुरानी मक्खियों को स्थानांतरित करें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लूसिफेरस परख किट के एक पेस्टल और लूसिफेरस लाइसिस बफर का उपयोग करके उन्हें लाइस करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लूसिफेरस परख किट और ल्यूमिनोमीटर का उपयोग करके फायरफ्लाई और रेनिला लूसिफेरस गतिविधि दोनों को मापने के लिए प्रत्येक नमूने से lysed ऊतक के 5 μL का उपयोग करें। 3. ऊतक-विशिष्ट विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में एक तीन घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर लक्ष्यीकरण UASt-CasRx और UASt-dCasRx अभिव्यक्ति वेक्टर जनरेट कर रहा है PCR प्लास्मिड pJFRC81 और प्राइमर 1041.C9 और 1041.C11 का उपयोग करके यूएएसटी प्रमोटर अनुक्रम को बढ़ाता है; फिर, पीसीआर प्लास्मिड OA-1050E (Addgene ID #132416) और प्राइमर 1050L का उपयोग करके CasRx टुकड़े को बढ़ाता है। C1 और 1050E C4; और फिर PCR प्लास्मिड OA-1050R (Addgene ID #132417) और प्राइमर 1050L का उपयोग करके dCasRx टुकड़े को बढ़ाता है। C1 और 1050E C4 (तालिका 1)26. जेल-प्रवर्धित UASt प्रमोटर अनुक्रम, CasRx, और dCasRx टुकड़े जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग कर शुद्ध. डाइजेस्ट बेस वेक्टर (Addgene plasmid #112686) प्रतिबंध एंजाइमों NotI और PacI24 के साथ। परिणामी उत्पादों में, जेल-बड़े टुकड़े को शुद्ध करें, जिसे जेल शुद्धिकरण किट का उपयोग करके बेस वेक्टर बैकबोन कहा जाता है। UASt-CasRx वेक्टर आधार वेक्टर बैकबोन, UASt प्रमोटर अनुक्रम, और CasRx टुकड़ा गिब्सन असेंबली का उपयोग कर के साथ इकट्ठा; फिर UASt-dCasRx वेक्टर आधार वेक्टर बैकबोन, UASt प्रमोटर अनुक्रम, और dCasRx टुकड़ा गिब्सन असेंबली विधि 25 का उपयोग कर के साथ इकट्ठा।नोट: UASt-CasRx वेक्टर Addgene प्लास्मिड #132418 है, और UASt-dCasRx वेक्टर Addgene प्लास्मिड #132419 है ट्रांसजेनिक मक्खियों का उत्पादन फ्लाई भ्रूण इंजेक्शन सेवा का उपयोग करके मक्खी भ्रूण में यूएएसटी-कैसरक्स वेक्टर इंजेक्ट करें और मक्खियों से भ्रूण ØC31 एकीकरण साइट 8621 उनके दूसरे गुणसूत्रों पर; तो UASt-dCasRx वेक्टर को मक्खी भ्रूण इंजेक्शन सेवा और मक्खियों से भ्रूण का उपयोग करके मक्खी भ्रूण में इंजेक्ट करें ØC31 एकीकरण साइट 8621 उनके दूसरे गुणसूत्रों पर। 26 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट किए गए भ्रूण को पीछे करें। CyO और Sb मार्करों के साथ डबल संतुलित विषमयुग्मजी लाइनों के रूप में मक्खियों रखें। नोट:: BDSC में फ्लाई लाइनों की ID 84121 (UASt-CasRx) और 84120 (UASt-dCasRx) हैं। फ्लाई जेनेटिक्स (चित्रा 1C) आदेश BDSC से वांछित GAL4 लाइनों; चरण 3.2.2 (या BDSC से) से प्रासंगिक gRNA पंक्तियाँ प्राप्त करें।नोट: BDSC से निम्न 2 GAL4 मक्खियों का उपयोग किया गया था: GAL4-GMR (BDSC ID: #29967), GAL4-y (BDSC ID: #44373)। पहले खंड में उत्पन्न एक ही 3 gRNA लाइनों का उपयोग किया गया था: gRNAw (BDSC ID: #84124), gRNAN (BDSC ID #84122), gRNAY (BDSC ID: #84123)। GRNA लाइन से 5-10 कुंवारी वयस्क मादा मक्खियों ले लीजिए. डबल संतुलित विषमयुग्मजी UASt-CasRx / CyO से 2-4 वयस्क पुरुष मक्खियों ले लीजिए; +/TM6, Sb लाइन जो सफेद आंखों, घुंघराले पंखों और dsRed प्रतिदीप्ति को एक साथ दिखाती है। एकत्रित मादा और नर मक्खियों को रखें, जो माता-पिता की मक्खियों हैं, एक नियमित भोजन की शीशी में (इसके बाद चरण 1 क्रॉस कहा जाता है)। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। नियंत्रण समूह के लिए, UASt-dCasRx/CyO का उपयोग करें; +/TM6, Sb लाइन जबकि सब कुछ एक ही रखने. 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली चरण 1 क्रॉस शीशियों को पीछे करें। फिर हर शीशी से सभी माता-पिता की मक्खियों को हटा दें। फिर शीशियों को कम से कम 14 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस समय के दौरान, GAL4 लाइन से 5-10 महिला कुंवारी इकट्ठा करें। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। हर दिन चरण 1 क्रॉस शीशियों का निरीक्षण करें यह देखने के लिए कि क्या कोई नई वयस्क मक्खी प्यूपे से उभरती है। यदि हां, तो उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एनेस्थेटिक करें, 2-4 पुरुष मक्खियों को इकट्ठा करें जो यूएएसटी-कैसरक्स (या यूएएसटी-डीसीएएसआरएक्स) और संतानों से जीआरएनए वेक्टर दोनों को व्यक्त करते हैं, जिनके पास एक साथ डीएसआरईड-फ्लोरोसेंट और स्टबल फेनोटाइप होते हैं। चरण 1 क्रॉस से एकत्र किए गए पुरुषों को GAL4 लाइन से 5-10 एकत्रित कुंवारी महिला के साथ एक नई शीशी में रखें (इसके बाद चरण 2 क्रॉस कहा जाता है)। 3 प्रतिकृतियों के लिए इस चरण को 3 बार दोहराएँ। 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर माता-पिता की मक्खियों वाली चरण 2 क्रॉस शीशियों को पीछे करें। फिर हर शीशी से सभी माता-पिता की मक्खियों को हटा दें। फिर शीशियों को कम से कम 20 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर रखें। यह देखने के लिए कि क्या कोई नया वयस्क मक्खी प्यूपे से उभरता है, हर दिन चरण 2 क्रॉस शीशियों का निरीक्षण करें। यदि हां, तो उन्हें कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एनेस्थेटिकाइज़ करें, एनेस्थेटिक मक्खियों के फेनोटाइप को स्कोर करें और फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से लैस रंग कैमरे का उपयोग करके उन्हें छवि दें। विभिन्न फेनोटाइप्स के साथ संतानों की संख्या की गणना करें। छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग और संकलन के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (चित्रा 4)।नोट: मेंडेलियन आनुवांशिकी का सुझाव है कि, यदि मक्खियां सभी व्यवहार्य हैं, तो चरण 2 क्रॉस से संतानों के बीच 4 प्रकार की मक्खियों की उम्मीद की जाती है, प्रत्येक आबादी के 25% के लिए लेखांकन (चित्रा 1 सी)।

Representative Results

एक दो-घटक CasRx सिस्टम का उपयोग कर विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापीF1 transheterozygous मक्खियों दोनों Ubiq-CasRx और gRNA (अंतर्जात और बहिर्जात जीन को लक्षित) दोनों को व्यक्त करने वाले निर्माणों ने नियंत्रण मक्खियों की तुलना में चिह्नित फेनोटाइप दिखाए जो Ubiq-dCasRx और gRNA निर्माणों को व्यक्त करते हैं (चित्रा 2 और चित्रा 4)। विशेष रूप से, transheterozygous CasRx मक्खियों में ट्रांसहेटेरोज़गियस dCasRx मक्खियों की तुलना में जीवित रहने की दर का स्तर काफी कम होता है, जो Ubiq-CasRx सिस्टम (चित्रा 2A और चित्रा 4A) की विषाक्तता का संकेत देता है। यह ध्यान देने योग्य है कि दोनों transheterozygous CasRx और dCasRx मक्खियों में 50% से कम विरासत दर है, जो मेंडेलियन आनुवांशिकी पर आधारित अपेक्षित अनुपात है। तीन लक्ष्य जीनों में से, Ubiq-CasRx / U6-gRNAN / + मक्खियों और Ubiq-CasRx / + U6-gRNAY / + मक्खियां गैर-व्यवहार्य (0% विरासत) हैं और दूसरे इंस्टार लार्वा चरण (चित्रा 2 ए -2 बी) से परे नहीं बढ़ी हैं। जीवित Ubiq-CasRx/ U6-gRNAw / + मक्खियों, जिनमें से विरासत 12.9% थी, ने एक अलग पूरी तरह से पेनिट्रेंट सफेद आंखों वाले फेनोटाइप (चित्रा 2 बी) को दिखाया। CasRx के साथ जुड़े अवलोकन योग्य लक्षणों के अलावा, हम 3 लक्ष्य जीनों के लिए लक्ष्य जीन टेपों की महत्वपूर्ण कमी की पुष्टि करने में सक्षम थे: पायदान, पीला, और जीएफपी (चित्रा 2ई-2 जी)। सफेद जीन टेपों की कमी Ubiq-CasRx / + , U6-gRNAw / + मक्खियों में देखी गई थी, नियंत्रण Ubiq-dCasRx / + , U6-gRNAw / + मक्खियों की तुलना में, हालांकि कमी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थी (चित्रा 2E – 2F)। CasRx द्वारा प्रेरित ऑफ-टारगेट गतिविधि का सबूत पाया गया था जब CasRx से नमूनों के बीच विभेदक रूप से व्यक्त किए गए टेपों की तुलना की गई थी- मक्खियों को व्यक्त करने वाली मक्खियों और dCasRx-व्यक्त मक्खियों (चित्रा 2E, 2G) से नमूने। गैर-लक्ष्य टेपों की संख्या काफी अलग-अलग रूप से व्यक्त की गई है: सफेद, 253 (कुल टेपों का 1.4%); पायदान, 300 (1.7%); पीला, 41 (0.23%); GFP, 5,880 (33%) (चित्रा 2G). कुल 17,779 विभिन्न टेपों में से, 6 गैर-लक्ष्य टेपों को नमूनों के सभी 4 समूहों में काफी अंतर से व्यक्त किया गया था। पहचाने गए 6 टेपों में से एक Gadd45 था, जो एपोप्टोसिस और मक्खियों में सेलुलर गिरफ्तारी में शामिल एक जीन था, जिससे यह संभावना बढ़ जाती है कि CasRx की एंजाइमेटिक कार्रवाई या तो सीधे सेलुलर एपोप्टोसिस को ट्रिगर कर सकती है या अप्रत्यक्ष रूप से अन्य जीनों के गलत अभिव्यक्ति को ट्रिगर कर सकती है, जो बदले में एपोप्टोसिस की ओर जाता है। अंत में, यह ध्यान देने योग्य है कि Ubiq-CasRx और Ubiq-dCasRx मक्खियों को होमोजीगस स्टॉक के रूप में स्थापित नहीं किया गया था, संभवतः उच्च सर्वव्यापी अभिव्यक्ति द्वारा प्रदान की गई विषाक्तता के कारण। नतीजतन, विषमयुग्मजी सर्वव्यापी-CasRx / CyO और Ubiq-dCasRx / CyO मक्खियों का उपयोग होमोजाइगस जीआरएनए फ्लाई लाइनों के साथ पार करने के लिए किया गया था। संक्षेप में, दो-घटक Ubiq-CasRx प्रणाली अंतर्जात और बहिर्जात लक्ष्यों दोनों के लिए सर्वव्यापी आरएनए लक्ष्यीकरण प्राप्त करने में सक्षम है, जिसके परिणामस्वरूप अवलोकन योग्य फेनोटाइप और प्रतिलेख में कमी होती है। इन परिणामों से यह भी पता चला है कि CasRx-मध्यस्थता आरएनए लक्ष्यीकरण विवो में विषाक्तता का परिचय दे सकता है। विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी एक तीन घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर लक्ष्यीकरणदो-चरणीय क्रॉस के परिणामों से पता चला है कि लक्ष्य जीन (यानी, फ्लूक) की बहिर्जात प्रकृति के बावजूद, F2 ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़ायगोट्स (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) में सभी तीन ट्रांसजीन को व्यक्त करने के परिणामस्वरूप 100% घातकता हुई, जिसमें Ubiq-dCasRx शामिल नियंत्रण क्रॉस की तुलना में 100% घातकता देखी गई, जहां F2 ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़ायगोट्स (Ubiq-dCasRx/+) में कोई घातकता नहीं देखी गई थी। ). अधिक विशेष रूप से, केवल सभी तीन ट्रांसजीन (Ubiq-CasRx / +; gRNAFluc / Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) के संयोजन के परिणामस्वरूप 100% घातकता (चित्रा 3B और D) हुई, जबकि (Ubiq-CasRx /+; gRNAFluc/TM6) और (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) जीनोटाइप व्यवहार्य थे और अपेक्षित मेंडेलियन संचरण दरों से मेल खाने वाली उनकी विरासत दरों के साथ फेनोटाइप की कमी थी, यह सुझाव देते हुए कि लक्ष्य अनुक्रम (यानी, जुगनूसी लूसिफेरस) की उपलब्धता Ubiq-CasRx / + और gRNAFluc के साथ संयोजन में है, जिसके परिणामस्वरूप मनाया घातकता फेनोटाइप, संभवतः Cas13 एंजाइमों की संपार्श्विक गतिविधि से उपजी 2,8 . इसके अलावा, F1 transheterozygotes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ या Ubiq-CasRx/+) में विरासत पर कोई अलग-अलग फेनोटाइप या नाटकीय प्रभाव नहीं; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) को Ubiq-dCasRx नियंत्रण (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ या Ubiq-dCasRx/+) की तुलना में देखा गया था; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (चित्रा 3B), यह दर्शाता है कि घातकता फेनोटाइप्स को प्राप्त करने के लिए एक उत्प्रेरक रूप से सक्रिय एंजाइम आवश्यक है। इसके अलावा, सभी व्यवहार्य जीनोटाइप की मक्खियों में फ्लूक और Rluc अभिव्यक्ति के स्तर ने दोहरी लूसिफेरस रिपोर्टर नियंत्रणों की तुलना में Ubiq-dCasRx ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़ायगोट्स (Ubiq-dCasRx /+; gRNAFluc / Ubiq-Ubiq-Ubiq-Rluc) में फ्लूक अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी नहीं दिखाई। इससे पता चलता है कि Fluc प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर dCasRx लक्ष्यीकरण (चित्रा 3 D) द्वारा कम नहीं किया गया था। एक साथ लिया गया, दो अलग-अलग CasRx-मध्यस्थता सर्वव्यापी आरएनए लक्ष्यीकरण प्रयोगों में आम घातकता फेनोटाइप इंगित करता है कि जब ऊतकों पर सर्वव्यापी रूप से उपयोग किया जाता है, तो CasRx-मध्यस्थता आरएनए लक्ष्यीकरण जीव के लिए विषाक्त हो सकता है। विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में ऊतक-विशिष्ट एक तीन-घटक CasRx सिस्टम का उपयोग करसर्वव्यापी आरएनए लक्ष्यीकरण प्रयोगों में देखी गई विषाक्तता के उच्च स्तर ने हमें विधि अनुभाग में विस्तृत तीन-घटक CasRx सिस्टम डिज़ाइन का उपयोग करके ऊतक-विशिष्ट आरएनए लक्ष्यीकरण का पता लगाने के लिए प्रेरित किया। दरअसल, विषाक्तता का स्तर कम हो गया था जब समग्र CasRx अभिव्यक्ति यूबीसी प्रमोटर की तुलना में यूएएसटी प्रमोटर का उपयोग करके कम हो गई थी, इसका उदाहरण तीन पहलुओं में दिया गया है: 1) यूएएसटी-कैसरक्स और यूएएसटी-डीसीएएसआरएक्स लाइनों को होमोजीगस लाइनों के रूप में बनाए रखा गया था, हालांकि दो-चरणीय क्रॉस स्कीम डबल संतुलित यूएएसटी-कैसआरएक्स और यूएएसटी-डीसीएएसआरएक्स लाइनों के आधार पर क्रॉस करने के लिए उपयोग किया गया था, 2) सभी F2 पीढ़ी dCasRx ट्रिपल transheterozygous विरासत दर अपेक्षित 25% मेंडेलियन विरासत दर से मेल खाती है, और 3) F2 पीढ़ी CasRx ट्रिपल transheterozygous घातकता फेनोटाइप मामूली रूप से कम हो गया था। सफेद लक्ष्यीकरण प्रयोग में, F2 ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़ायगोट्स में अपेक्षित 25% मेंडेलियन विरासत दरों में से, केवल 0.57% व्यवहार्य वयस्क मक्खियों (UASt-CasRx / +; gRNAw / GMR-Gal4) को देखा गया था, जिनमें से सभी ने गंभीर आंख विशिष्ट रंजकता और आकृति विज्ञान फेनोटाइप (चित्रा 4 ए और 4 बी) प्रदर्शित किए थे। सफेद-लक्ष्यीकरण क्रॉस के लिए, CasRx-अभिव्यक्त ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़िगस F2 वंशानुक्रम दर dCasRx-व्यक्त ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़िगस नियंत्रण समूह (27.6%) (चित्रा 4A) की तुलना में काफी कम थी। नॉच लक्ष्यीकरण प्रयोग में, CasRx-व्यक्त ट्रिपल tranheterozygous सभी तीन transgenes ले जाने 100% घातक थे, जबकि dCasRx नियंत्रण विरासत दर 29.3% (चित्रा 4A) था। पीले लक्ष्यीकरण प्रयोग में, F2 ट्रिपल transheterozygous CasRx-व्यक्त, gRNAY, और y-GAL4 ने 2.67% की विरासत दर के साथ वक्ष और पेट पर पीले छल्ली के छोटे पैच के रूप में सीमांत चिटिन वर्णक कमी दिखाई, जो dCasRx नियंत्रण समूह (25.2%) (चित्रा4A) की तुलना में बहुत कम है। ). सभी dCasRx नियंत्रण ट्रिपल transheterozygous मक्खियों CasRx-व्यक्त मक्खियों के रूप में स्पष्ट फेनोटाइप प्रस्तुत नहीं किया, यह दर्शाता है कि CasRx की उत्प्रेरक गतिविधि ने फेनोटाइप ्स में योगदान दिया। CasRx ट्रिपल transheterozygous समूह में कम वंशानुक्रम दर ने सुझाव दिया कि CasRx RNA लक्ष्यीकरण में विषाक्तता के दो स्रोत मौजूद हैं: एक CasRx की उच्च अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है, जिसकी विषाक्तता प्रतिबंधात्मक CasRx अभिव्यक्ति द्वारा कम हो गई थी, दूसरा संपार्श्विक गतिविधि से जुड़ा हुआ है। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चला है कि CasRx प्रणाली शास्त्रीय Gal4 / UASt प्रणाली का लाभ उठाकर विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में ऊतक-विशिष्ट प्राप्त कर सकती है और इस बीच विषाक्तता को कम कर सकती है। हालांकि, विषाक्तता और कभी-कभी घातकता फेनोटाइप्स को अभी भी सर्वव्यापी दृष्टिकोणों की तुलना में गंभीरता के निचले स्तर पर देखा गया था, यह दर्शाता है कि संपार्श्विक दरार गतिविधि विषाक्तता से जुड़ी हुई है। चित्रा 1: Cas13D सिस्टम का उपयोग करके RNA लक्ष्यीकरण का सामान्य अवलोकन. (A) दो-घटक CasRx सिस्टम का उपयोग करके विवो RNA लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी में एक-चरणीय आनुवंशिक क्रॉस की स्कीमेटिक्स. (बी) तीन-घटक CasRx प्रणाली का उपयोग करके विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी में एक दो-चरणीय आनुवंशिक क्रॉस की योजनाबद्धता। (सी) एक तीन-घटक CasRx प्रणाली का उपयोग करके विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में ऊतक-विशिष्ट में एक दो-चरणीय आनुवंशिक क्रॉस की योजनाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 2: एक दो-घटक CasRx प्रणाली (reprinted5) का उपयोग कर vivo RNA लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी. (A) Ubiq-CasRx (या Ubiq-dCasRx) और gRNAs विरासत में transheterozygous मक्खियों के कुल वंशानुक्रम प्रतिशत. बॉक्स प्लॉट में नीला छायांकन फेनोटाइप पेनेट्रेंस को इंगित करता है। (बी) ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियों के फेनोटाइप्स। तीर आंख में ऊतक परिगलन को इंगित करते हैं। ‘एक्स’ के साथ चिह्नित काली और सफेद मक्खी घातकता का प्रतिनिधित्व करती है। (C) Ubiq-CasRx (या Ubiq-dCasRx) और gRNAGFP-OpIE2-GFP मक्खियों के बीच द्विदिश क्रॉस की ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियों का कुल वंशानुक्रम प्रतिशत। एम, CasRx के मातृ विरासत; पी, CasRx के पैतृक विरासत. (डी) पैतृक क्रॉस में एफ 1 लार्वा संतानें। (ई) लॉगरिदमिक गुना परिवर्तन के लिए ‘टेपों’ अधिकतम एक पश्चवर्ती अनुमान. DESeq2 पाइपलाइन का उपयोग किया गया था। (एफ) प्रति मिलियन (TPM) प्रतिलिपियाँ CasRx या dCasRx के साथ लक्षित. (जी) CasRx-depentent differentially प्रतिलेखों के प्रतिलेख प्रतिशत व्यक्त किया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 3: विवो बहिर्जात आरएनए लक्ष्यीकरण में सर्वव्यापी एक तीन-घटक CasRx प्रणाली का उपयोग कर लक्ष्यीकरण. (A) दो-चरणीय आनुवंशिक क्रॉस की योजनाबद्धता। (बी) एफ 2 पीढ़ी में उभरने वाले सभी जीनोटाइप के लिए कुल विरासत प्रतिशत। F2 संतानों में सभी तीन ट्रांसजीन (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, और gRNAFLuc) को विरासत में लेने के परिणामस्वरूप 100% घातकता हुई और Ubiq-dCasRx ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़ायगेट्स कंट्रोल ग्रुप (p = 0.001, t-test) की तुलना में काफी कम था। (C) अकेले Ubiq-CasRx/gRNAFluc या Ubiq-CasRx और Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc अकेले ले जाने से गंभीर घातकता नहीं हुई, और Ubiq-CasRx और Ubiq-dCasRx transheterozygotes के बीच वंशानुक्रम अनुपात काफी भिन्न नहीं थे (p = 0.41 और p = 0.51, क्रमशः, t-test)। (डी) लूसिफेरस अनुपात Rluc रीडिंग के लिए Fluc रीडिंग को सामान्य बनाने. Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc को व्यक्त करने वाली ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियां भ्रूण घातक थीं, जिन्हें “एक्स” के साथ एक मक्खी द्वारा दर्शाया गया था, और परिणामस्वरूप लूसिफेरस अभिव्यक्ति को मापा नहीं गया था। Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes का Fluc/Rluc अनुपात अन्य Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-expressing groups (p = 1.2e-06 या उससे कम, t-test) की तुलना में काफी कम था। gRNAFLuc-केवल समूह के परिणाम अन्य सभी समूहों की तुलना में काफी कम थे (p = 1.2e-06 या उससे कम, t-test)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 4: तीन-घटक CasRx प्रणाली (पुनर्मुद्रित5) का उपयोग करके विवो आरएनए लक्ष्यीकरण में ऊतक-विशिष्ट. (A) ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियों का कुल वंशानुक्रम प्रतिशत तीन ट्रांसजीन (UASt-CasRx या UASt-dCasRx, gRNA, और Gal4-ड्राइवर) ले जाता है। (बी) ट्रिपल ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियों के फेनोटाइप्स। सफेद तीर वक्ष में चिटिन वर्णक कमी को इंगित करता है। ‘एक्स’ के साथ चिह्नित काली और सफेद मक्खी घातकता का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. बनाना वर्णन प्रवेशिका प्राइमर अनुक्रम (5′ से 3′) PCR टेम्पलेट OA-1050E CasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCACATCTCTATTGACCCGCAGATTAATTAATGAGCCCCAAGAAGAA pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx) 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA OA-1050R dCasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCACATCTCTATTGACCCGCAGATTAATTAATGAGCCCCAAGAAGAA pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx) 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA OA-1050L यूएएसटी प्रमोटर 1041.C9 GCGGGTTCTCGACGGTCACGGGGGGGGGCATGTCGACGCGGCCGCAACCAACAACACTAGTAG pJFRC81 1041.C11 CTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGGCTCATGTTTAAACCCAATTCCCTATTCAGA CasRx 1050L. C1 AATACAAGAAGAAGAGAACTCTGAATAGGGAATTGGGTTTAAACATGAGCCCCAAGAAGAA pCasRx 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA OA-1050S यूएएसटी प्रमोटर 1041.C9 GCGGGTTCTCGACGGTCACGGCGGGCATGTCGACGCGGCCGCAACCAACAACACTAGTAG pJFRC81 1041.C11 CTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGGCTCATGTTTAAACCCAATTCCCTATTCAGA dCasRx 1050L. C1 AATACAAGAAGAGAACTCTGAATAGGGAATTGGGTTTAAACATGAGCCCCAAGAAGAA pdCasRx 1050E. C4 CAATTGATTTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGCTAGCTTAAGCGTAATCTGGAACA OA-1043 U6:3 प्रमोटर 1043.C1 GGGAATTGGGAATTGGGCAATATTTAAATGGCGGCGCGCCGAATTCTTTTTTGCTCACCT Addgene प्लास्मिड #164586 1043.C23 ACACTAGTGGATCTCTAGAGGTACCGTTGCGGCCGCAAAAAAGTTGTAATAGCCCCTCAAAACTGGACCTTCCACAACTGCAGCCGACGTTAAATTGAAA OA-1052B Ubiq प्रमोटर 1052B. C1 GGGAATTGGGCAATATTTAAATGGCGGCTGCAGCGCGCAGATCGCCGAT Addgene प्लास्मिड #112686 1052B. C2 TTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATCCTAGGTCTGCGGGTCAAAATAGAGATG T2A-eGFP 908A1 ATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGC Addgene प्लास्मिड #112686 908A2 TTGTTATTTTAAAAACGATTCATTCTAGGCGATCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC उलट Ubiq प्रमोटर 908A3 ACCGTGACCTACATCGTCGACACTAGTGGATCTCTAGACGCGCAGATCGCCGATG Addgene प्लास्मिड #112686 908A4 GGATCATAAACTTTCGAAGTCATGCGGCCGCTCTGCGGGTCAAAAAATAGAGATGT तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले आणविक निर्माण और प्राइमरों की सूची। इस सूची में सभी निर्माण (आईडी और विवरण दोनों) और प्रत्येक निर्माण के संबंधित प्राइमर (आईडी और अनुक्रम (5′ से 3′) दोनों) और उपयोग किए गए टेम्पलेट्स शामिल हैं।

Discussion

CasRx प्रणाली के तीन अलग-अलग अनुप्रयोग डिजाइनों के साथ, इस काम ने मक्खियों में vivoprogramable RNA लक्ष्यीकरण में प्रदर्शित किया। विभिन्न रणनीतियां विभिन्न परियोजना आवश्यकताओं को पूरा करती हैं, जैसे कि अंतर्जात बनाम बहिर्जात जीन लक्ष्यीकरण और सर्वव्यापी बनाम ऊतक-विशिष्ट आरएनए लक्ष्यीकरण। आरएनए लक्ष्यीकरण के प्रभावों में लक्ष्य जीन विशिष्ट फेनोटाइपिक परिवर्तन, लक्ष्य आरएनए प्रतिलेख में कमी, और कभी-कभी घातकता फेनोटाइप शामिल थे जो CasRx प्रोटीन और संपार्श्विक गतिविधि की उच्च अभिव्यक्ति से जुड़े थे। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चला है कि CasRx प्रणाली एक प्रोग्राम योग्य और कुशल तरीके से जीव स्तर पर आरएनए प्रतिलेख में कमी को लक्षित करने में सक्षम है।

CasRx सिस्टम के सफल अनुकूलन में प्रमुख कारकों में से एक gRNAs का डिजाइन है। विशेष रूप से, निम्नलिखित सलाह पर ध्यान दिया जाएगा: लक्ष्य अनुक्रम लंबाई में लगभग 30 न्यूक्लियोटाइड है, लक्ष्य अनुक्रम में पॉली-यू स्ट्रेच की लंबाई 4 आधार जोड़े या उससे कम है, लक्ष्य अनुक्रम जीसी सामग्री 30% – 70% की सीमा में है, लक्ष्य अनुक्रम को मजबूत आरएनए हेयरपिन संरचनाओं को बनाने की भविष्यवाणी नहीं की गई है, और लक्ष्य अनुक्रम में न्यूनतम अनुमानित आरएनए माध्यमिक या तृतीयक संरचना 5 शामिल है।

जीआरएनए डिजाइनों के अलावा, प्रत्येक प्रोटोकॉल में फ्लाई जेनेटिक्स चरण भी एक सफल कार्यान्वयन में महत्वपूर्ण है। संतानों में माता-पिता से पारित परिभाषित फेनोटाइप्स की उपस्थिति या कमी ट्रांसहेटेरोज़िगस संतानों में CasRx प्रणाली द्वारा प्रेरित फेनोटाइप्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, समानांतर में dCasRx मक्खियों का उपयोग करके नियंत्रण क्रॉस की स्थापना भी transheterozygous संतानों में गैर-विशिष्ट फेनोटाइप्स को बाहर निकालने में सहायक है।

यह ध्यान देने योग्य है कि इन परिणामों ने सर्वव्यापी रूप से Fly में CasRx और dCasRx प्रोटीन को व्यक्त करके पेश की गई विषाक्तता के मुद्दे का खुलासा किया, जो CasRx सिस्टम की एक सीमा है। अकेले Ubiq promotor के तहत CasRx या dCasRx की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति, gRNAs के बिना, nontrivial फिटनेस लागत के साथ आया था, क्योंकि न तो Ubiq-CasRx और न ही Ubiq-dCasRx मक्खियों को होमोजीगस लाइनों के रूप में स्थापित किया जा सकता है। इसके विपरीत, UASt-CasRx और UASt-dCasRx मक्खियों को स्वस्थ होमोजीगस स्टॉक के रूप में स्थापित किया जा सकता है, हालांकि क्रॉस स्कीम के डिजाइन के कारण उन्हें डबल-संतुलित स्टॉक के रूप में रखा गया था, एक तथ्य जो सर्वव्यापी CasRx प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित विषाक्तता के अस्तित्व का समर्थन करता है। सहायक साक्ष्य का एक और टुकड़ा यह है कि नियंत्रण प्रयोगों में dCasRx शामिल है, जो उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय है, F1 पीढ़ी में मक्खियों की कुल संख्या में से dCasRx और gRNA दोनों निर्माणों को ले जाने वाली मक्खियों के प्रतिशत लगातार 50% से कम थे, मेंडेलियन आनुवांशिकी के आधार पर अपेक्षित अनुपात यदि कोई dCasRx-संबद्ध विषाक्तता मौजूद नहीं थी। इसने संकेत दिया कि सर्वव्यापी रूप से व्यक्त dCasRx, gRNas के साथ, मक्खी में विषाक्तता को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षित विरासत अनुपात से कम होता है। Transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 मक्खियों के वंशानुक्रम अनुपात ने मेंडेलियन आनुवांशिकी का पालन किया, जो फिर से CasRx और dCasRx प्रोटीन की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति द्वारा विशेष रूप से प्रेरित विषाक्तता का सुझाव देता है। CRISPR/Cas प्रणाली में विषाक्तता नई नहीं है। Cas9 प्रोटीन की उच्च मात्रा को कई जीवों में विषाक्त दिखाया गया है, जिसमें मक्खियों 29,30,31,32 शामिल हैं। हाल के एक अध्ययन ने एक अनुकूलित GAL4 / UAS प्रणाली विकसित की है जो UAS-Cas9 construct33 में UAS अनुक्रम और Cas9 अनुक्रम के बीच अलग-अलग लंबाई का एक खुला-पढ़ने वाला फ्रेम जोड़कर मक्खियों में व्यक्त Cas9 प्रोटीन की मात्रा को ट्यून कर सकती है। इसलिए, यह CasRx प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर ट्यूनिंग द्वारा CasRx-प्रेरित विषाक्तता को कम करने के तरीकों की खोज के लायक है।

CasRx और dCasRx प्रोटीन की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति से प्रेरित विषाक्तता के अलावा, परिणामों ने CasRx सिस्टम के गैर-विशिष्ट संपार्श्विक ऑफ-टारगेट प्रभावों से जुड़ी घातकता भी दिखाई, जो कई CRISPR सिस्टम 1,2,7,34 की एक विशेषता है। CasRx और गैर-आवश्यक जीन gRNA-व्यक्त डबल या ट्रिपल transheterozygous मक्खियों में से कुछ में, उदाहरण के लिए जब पायदान को लक्षित करते हैं, transheterozygous CasRx मक्खियों में transheterozgyous dCasRx मक्खियों की तुलना में जीवित रहने की दर का स्तर काफी कम होता है। इन CasRx और gRNA-व्यक्त transheterozygous मक्खियों के RNA-seq विश्लेषण में, लक्ष्य जीन प्रतिलेख स्तरों की कमी और गैर-लक्ष्य जीन टेपों की कमी दोनों को देखा गया था। ये संपार्श्विक प्रभाव CasRx-निर्भर और लक्ष्य-निर्भर थे, क्योंकि वे केवल CasRx प्रोटीन और gRNA दोनों को व्यक्त करने वाले ट्रांसहेटेरोज़िगस मक्खियों में देखे गए थे। यह इंगित करने योग्य है कि लक्ष्य जीनों में से एक, सफेद, ने टेपों में केवल एक सीमित, गैर-सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी दिखाई, जब सफेद जीन को कैसरक्स द्वारा लक्षित किया गया था, जो स्पष्ट वर्णक कमी फेनोटाइप के विपरीत था। यह परिकल्पना की गई है कि यह इस तथ्य के कारण हो सकता है कि 1) आरएनए-सेक नमूना संग्रह का समय उस समय के साथ अच्छी तरह से संरेखित नहीं था जब सफेद जीन प्रारंभिक विकास के दौरान अपनी चरम अभिव्यक्ति तक पहुंचता है, और 2) आंखों में सफेद जीन की स्थानीयकृत अभिव्यक्ति प्रारंभिक विकास चरण के दौरान प्रासंगिक ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाती है जब केवल पूरे शरीर का नमूना संग्रह संभव होता है। CasRx प्रणाली में संपार्श्विक गतिविधि को कम करने के लिए, भविष्य के अध्ययनों को जीव स्तर पर ऑफ-टारगेट घटना प्रणाली के अंतर्निहित तंत्र को पूरी तरह से समझने के लिए कहा जाता है।

दिलचस्प बात यह है कि मक्खियों में आरएनए-लक्ष्यीकरण Cas13 उपकरणों का वर्णन करने वाले एक हालिया अध्ययन 35 कई संभावित कारणों से CasRx अभिव्यक्ति से जुड़े सामान्य विषाक्तता में सुधार करने के लिए दिखाई दिए। सबसे पहले, लेखकों ने ड्रोसोफिला में अभिव्यक्ति को अनुकूलित करने के लिए कैस 13 ट्रांसजीन को फिर से कोडित किया और वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले यूबिकिटिन प्रमोटर की तुलना में अधिक कमजोर रूप से व्यक्त करने वाले प्रमोटर (एक्टिन 5 सी) का उपयोग किया, संभवतः कैस 13 अभिव्यक्ति के निचले स्तर और इस प्रकार कम विषाक्तता के लिए अग्रणी। दरअसल, यह टिप्पणियों द्वारा समर्थित है कि यूएएसटी-संचालित CasRx और dCasRx अभिव्यक्ति, अपने आप में, विषाक्त नहीं थी, क्योंकि यह अध्ययन (और 35 में लेखकों) ने यूएएसटी-कैसरक्स मक्खियों में किसी भी स्पष्ट घातकता का निरीक्षण नहीं किया था। इसके अलावा, इन लेखकों ने इस अध्ययन की तुलना में अपने जीआरएनए को अलग-अलग एन्कोड किया, जिसने उनकी अभिव्यक्ति को प्रभावित किया हो सकता है और ट्रांसहेटेरोज़िगस कैस 13 / जीआरएनए मक्खियों में सिस्टम की विषाक्तता को कम कर दिया है। उदाहरण के लिए, उनके अध्ययन में दो जीआरएनए को U6: 3 प्रमोटर का उपयोग करके व्यक्त किया गया था और CasRx35 की आवश्यकता के बिना tRNA परिपक्वता पर gRNA प्रसंस्करण को सक्षम करने के लिए tRNA द्वारा flanked किया गया था। इसके विपरीत, इस अध्ययन में, जीआरएनए को प्रति जीन 4 स्थानों तक लक्षित करने वाले सरणियों के रूप में एन्कोड किया गया था और बैक्टीरिया में पाए जाने वाले अंतर्जात कैस 13 सरणी संरचना की नकल की गई थी, जिसके लिए प्रत्येक जीआरएनए को संसाधित करने के लिए कैस 13 एंजाइम की आवश्यकता होती है। इन विभिन्न दृष्टिकोणों ने जीआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर और अन्य कारकों में अंतर किया हो सकता है जो पूरे सिस्टम की विषाक्तता पर अंतर्निहित प्रभाव डाल सकते हैं। अंत में, Huynh et al. ने वर्तमान अध्ययन में लक्षित लोगों की तुलना में विभिन्न जीनों को लक्षित किया, जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य-Cas / gRNA इंटरैक्शन और संपार्श्विक गतिविधि में अंतर होता है और घातकता के देखे गए स्तरों पर प्रभाव पड़ सकता है। मनाया विषाक्तता में ये अंतर उन तरीकों की पहचान करने के लिए आगे की जांच की गारंटी देते हैं जो समग्र प्रणालियों में सुधार किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, यह अध्ययन डी मेलानोगास्टर में एक कार्यात्मक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड प्रोग्राम योग्य आरएनए-टार्गेटिंग कैस सिस्टम का पहला प्रदर्शन है, हालांकि कैसआरएक्स सिस्टम के आगे अनुकूलन (जो रिपोर्ट किया गया है 35 के अनुरूप) को ऑफ-टारगेट-संबद्ध घातकता को कम करने और कैसरक्स ऑन-टारगेट क्लीवेज की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए आवश्यक होगा। कैस एंजाइमों के साथ आरएनए-लक्ष्यीकरण कीट वेक्टर नियंत्रण से लेकर चिकित्सीय उपयोग1,2,3,4,5,6,7 तक के कई संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक तेजी से विकसित क्षेत्र है, और यह प्रोटोकॉल मक्खियों में अपने पहले CasRx सिस्टम को डिजाइन करने में रुचि रखने वाले किसी भी व्यक्ति के लिए एक स्टार्टर पैकेज प्रदान करता है, जबकि सिस्टम के अनुकूलन और आगे के अनुकूलन के साथ संगत है। यहां प्रस्तुत किए गए उदाहरण विवो में इस सिस्टम के कार्यान्वयन के दौरान आने वाले परिणामों की एक श्रृंखला को प्रदर्शित करते हैं और अपने अनुप्रयोगों में CasRx सिस्टम के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने में अन्य उपयोगकर्ताओं के लिए बेंचमार्क के रूप में कार्य कर सकते हैं।

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को DARPA सुरक्षित जीन कार्यक्रम अनुदान (HR0011-17-2-0047) से वित्त पोषण द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और एनआईएच पुरस्कार (R21RAI149161A, DP2AI152071) O.S.A. को सम्मानित किया गया था।

Materials

100% Grape Juice Welch Foods Inc. N/A
Active Dry Yeast (908g) Red Star Yeast Company, LLC N/A
DMC4500 color camera Leica Microsystems DMC4500
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
GAL4-GMR flies Bloomington Drosophila Stock Center 29967
GAL4-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 44373
Glomax 20/20 Luminometer Promega E5331
Illumina HiSeq2500 Sequencer Illumina, Inc. HiSeq2500
M165FC fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems M165FC
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer ThermoFisher NDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit New England Biolabs, Inc. E7770
plasmid # 112686 Addgene 112686
plasmid # 112688 Addgene 112688
plasmid # 132416 Addgene 132416
plasmid # 132417 Addgene 132417
plasmid # 132419 Addgene 132419
plasmid # 132420 Addgene 132420
plasmid # 132421 Addgene 132421
plasmid # 132422 Addgene 132422
plasmid # 132425 Addgene 132425
plasmid # 132426 Addgene 132426
plasmid # 133304 Addgene 133304
plasmid # 164586 Addgene 164586
plasmid #132418 Addgene 132418
plasmid pJFRC81 Addgene 36432
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Restriction endonucleases AscI New England Biolabs Inc. R0558L
Restriction endonucleases NotI New England Biolabs Inc. R0189L
Restriction endonucleases PacI New England Biolabs Inc. R0547L
Restriction endonucleases PstI New England Biolabs Inc. R0140L
Restriction endonucleases SwaI New England Biolabs Inc. R0604L
Restriction endonucleases XbaI New England Biolabs Inc. R0145L
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer Agilent Technologies 5067-1513
Turbo DNase Invitrogen AM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc flies Bloomington Drosophila Stock Center 84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies Bloomington Drosophila Stock Center 84986
U6-3:4-gRNA-N flies Bloomington Drosophila Stock Center 84122
U6-3:4-gRNA-w flies Bloomington Drosophila Stock Center 84124
U6-3:4-gRNA-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 84123
UASt-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84121
UASt-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84120
Ubiq-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84118
Ubiq-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies Bloomington Drosophila Stock Center 84127
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits Zymo Research Corporation D4007
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Referências

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Sun, R., Brogan, D., Buchman, A., Yang, T., Akbari, O. S. Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx. J. Vis. Exp. (168), e62154, doi:10.3791/62154 (2021).
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