이 문서에서는 RNA 표적 Cas13D 효소(RfxCas13D)를 파리에서 사용하기 위한 상세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
CASRx, RNA 표적 Cas13 가족의 일원은, 세포와 유기체 수준 둘 다에 매력적인 오프 표적 단면도를 가진 효율적인 유전자 전사량 감소에 있는 CRISPR/Cas 기술의 유망한 새로운 추가입니다. 그것은 최근 CRISPR/CasRx 시스템은 Drosophila 멜라노가스터에 있는 유비쿼터스 및 조직 특정 유전자 성적증명서 감소를 달성하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보고됩니다. 본 논문은 2성분 CasRx 시스템을 이용하여 생체 내생 RNA 표적화의 3개 부분으로 구성된 최근 작업에서 의 방법을 자세히 설명한다. 2) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 외인성 RNA 표적화에서 유비쿼터스; 및 3) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 내 RNA 표적질내 조직별. 관찰된 RNA 표적화의 효력은 CasRx 단백질 및 부수적 활동의 높은 발현과 관련되었던 표적 유전자 특정 표현표 변경, 표적으로 한 RNA 전사량 감소 및 간헐적인 치사성 표현형을 포함합니다. 전반적으로, 이러한 결과는 CasRx 시스템이 프로그래밍 가능하고 효율적인 방식으로 유기체 수준에서 표적 RNA 전사 감소를 할 수 있음을 보여주었으며, 생체 내 전사 타겟팅, 엔지니어링이 실현 가능하고 생체 내 CRISPR 기반 RNA 표적화 기술의 미래를 위한 토대를 마련한다는 것을 입증했다.
클러스터드 의 출현 이후 정기적으로 간격 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR) 기술, 이 분야에서 초점의 대부분은 DNA 편집에있었다, 이는 의학 및 생명 공학에 변형 응용 프로그램을 제공합니다1. 그러나 DNA 서열의 영구적인 변경은 윤리적 고려 사항으로 인해 항상 바람직하지는 않습니다. 이에 비추어, 최근 연구는 RNA를 표적으로 하는 CRISPR 기지를 둔 공구를 개발하기 시작하고 CRISPR 기술이 실제로 다양한 생물학 체계2,3,4,5,6,7에서 RNA 표적에 실제로 사용될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 테스트된 많은 시스템에서, RNA 및 전사감소를 표적으로 하는 현재 널리 사용되는 접근법은 RNA 간섭(RNAi)이며, 이는 완벽하지 않으며, 생체 내에서 사용될 때 다양한 효능과 높은 오프타겟 활성을 종종 나타내고 있습니다.8,9,10,12,13,15,16,17 . 따라서 이러한 기술의 상태를 감안할 때 RNA 표적화를 위한 CRISPR 기반 도구의 잠재력을 더 탐구할 가치가 있습니다.
한 주목할만한 최근 연구는 Ribonuclease CasRx, Cas13d 클래스의 일원, 효율적으로 인간의 세포 배양에 있는 유전자 성적증명서 수준을 감소시킬 수 있고 매력적인 오프 표적 profile4를 소유한다는 것을 보고했습니다. 이 사실 인정은 이 새로운 ribonuclease가 유기체 수준에서 표적으로 하는 RNA를 위한 그것의 효험 그리고 낮은 오프 표적 비율을 유지할 수 있는지의 질문으로 이끌어 냈습니다. 최근 연구는 CasRx 시스템이 Drosophila melanogaster5에 있는 유비쿼터스 및 조직 특정 유전자 성적증명서 감소를 달성하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줌으로써 이 질문을 해결했습니다.
이 최근에 발표된 접근 방식의 유용성을 간소화하기 위해 이 프로토콜은 3가지 주요 부분으로 구성된 이 최근 작업의 방법을 자세히 설명합니다: 1) 2성분 CasRx 시스템을 사용하여 생체 RNA 표적화에서 유비쿼터스; 2) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 생체 외인성 RNA 표적화에서 유비쿼터스; 및 3) 3성분 CasRx 시스템을 이용한 조직 특이적 생체내 RNA 표적.
유비쿼터스 프로모터의 통제 하에 상이한 표적 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)가 이러한 gRNA 함유 구조를 발현하는 플라이 라인을 설계하고 플라이 라인이 생성되었다. CasRx는 유비쿼터스 프로모터 또는 GAL4 전사 인자에 의해 활성화 가능한 조건부 업스트림 활성화 서열(UASt) 프로모터의 제어하에, 또한 이러한 CasRx 함유 구조물을 수용하는 라인을 설계및 플라이 라인으로 설계하였다. 촉매비활성 CasRx 구문인 dCasRx는 음의 컨트롤로 설계및 사용되었습니다. 파리에서 유비쿼터스 RNA 타겟팅은 유비쿼터스 캐스락스 표현 플라이 라인으로 gRNA 표현 플라이 라인을 교차하여 달성됩니다. 특정 유전자 전사체와 CasRx 단백질을 대상으로 하는 gRNA 구조를 모두 발현하는 자손은 표적 유전자 전사체의 유비쿼터스 감소를 갖는다. 파리에서 조직별 RNA 표적화는 UASt-CasRx가 파리를 발현하는 gRNA 발현 파리를 처음 건널때 달성되어 gRNA와 UASt-CasRx 구조를 모두 운반하는 트랜스헤터로즈구우스 파리를 얻습니다. 이러한 파리는 차례로 조직 별 GAL4 표현 파리와 교차하여 파리에서 조직별 CasRx 발현 및 RNA 표적화의 생성을 초래합니다.
CasRx 시스템의 프로그래밍 가능한 특성은 생체 내 RNA 표적화에 대한 높은 효능과 낮은 오프 타겟 활동을 달성하는 데 도움이 되는 사용자 정의 및 최적화가능성을 제공합니다. CRISPR 기반 RNA 표적팅의 잠재적인 응용 은 실험실에서 RNAi를 대체하고 야생에서 곤충 벡터 제어에 기여하는 것을 포함하여 수많은 것입니다. 후자의, 글로벌 충족 되지 않은 요구 중 하나는 모기를 통해 전송 하는 RNA 바이러스의 감염을 방지 하기 위해 효율적인 도구의 개발. 뎅기열, Zika 및 chikungunya 바이러스와 같은 많은 RNA 바이러스는 모기를 통해 전달되고, 인간의 건강에 영향을 미치고, 사망을 기여합니다. 질병 예방을 위한 바이러스 저항을 가진 공학 모기 인구를 위한 많은 제안이 만들어졌습니다; 그러나, 현재 기술은 모기가 모든 중요한 RNA 바이러스18,19,20,21,22,23에 동시에 저항하는 것을 만들 수 없습니다. RNA 표적화 Cas 시스템은 모든 모기 매개 RNA 바이러스를 표적으로 하는 프로그래밍 가능한 플랫폼을 가능하게 함으로써 이러한 기술에 대한 출발점을 제공할 수 있다.
CasRx 시스템의 세 가지 응용 프로그램 설계로,이 작품은 파리에서 생체 프로그래밍 가능한 RNA 타겟팅에서 입증되었습니다. 다른 전략은 내인성 대 외인성 유전자 표적화 및 조직 특정 RNA 표적화 대 유비쿼터스와 같은 다른 프로젝트 요구를 수용합니다. RNA 표적화의 효력은 CasRx 단백질 및 부수적 활동의 높은 발현과 관련되었던 표적 유전자 특정 표현성 변경, 표적 RNA 전사량 감소 및 간헐적인 치사성 표현형을 포함했습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 CasRx 시스템이 프로그래밍 가능하고 효율적인 방식으로 유기체 수준에서 표적 RNA 전사감소가 가능한 것으로 나타났다.
CasRx 시스템의 성공적인 사용자 정의의 주요 요소 중 하나는 gRNA의 설계입니다. 구체적으로, 다음의 조언은 주의해야 한다: 표적 서열은 길이약 30뉴클레오티드, 표적 서열에서 폴리-U 뻗어의 길이는 4기층 이하이며, 표적 서열 GC 함량은 30% -70%의 범위에 있으며, 표적 서열은 강력한 RNA 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예측되지 않으며, 표적 서열은 최소한의 예측 RNA 또는 대동맥 구조를 포함한다55.
gRNA 설계 외에도 각 프로토콜의 플라이 유전학 단계는 성공적인 구현에서도 중요합니다. 자손의 부모로부터 계승된 정의된 표현형의 존재 또는 부족은 트랜스페테로지구스 자손에서 CasRx 시스템에 의해 유도된 표현형을 식별하고 정량화하는 데 중요하다. 또한, dCasRx 파리를 병렬로 사용하여 제어 십자가를 설정하는 것은 또한 transheterozygous 자손에서 비 특이적 표현형을 배제하는 데 도움이됩니다.
이러한 결과 밝혀 독성 문제 유비 쿼터스 로 발현 CasRx 와 dCasRx 단백질 즉석에서, CasRx 시스템의 제한. Ubiq promotor에서 단독으로 CasRx 또는 dCasRx의 유비쿼터스 표현은 gRNAs없이, 비 사소한 피트니스 비용과 함께, Ubiq-CasRx 또는 Ubiq-dCasRx 파리는 homozygous 라인으로 설립 될 수 없습니다. 반대로, UASt-CasRx 및 UASt-dCasRx 파리는 건강한 호모자구스 주식으로 확립될 수 있지만, 크로스 계획의 설계로 인해 이중 균형 주식으로 유지되었지만 유비쿼터스 CasRx 단백질 발현에 의해 유발되는 독성의 존재를 뒷받침하는 사실이다. 또 다른 지원 증거는 dCasRx와 관련된 대조 실험에서, 이는 촉매적으로 비활성, F1 세대에 있는 파리의 총 수에서 dCasRx와 gRNA 구조물을 모두 운반하는 파리의 백분율은 일관되게 50% 보다 낮았다, dCasRx 관련 독성이 없는 경우에 Mendelian 유전학에 근거를 둔 예상비율. 이것은 gRNA와 함께 dCasRx를 유비쿼터스로 표현하는 것이 즉석에서 독성을 유도하여 예상보다 적은 상속 비율을 초래한다는 것을 나타냈습니다. transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 파리의 상속 비율은 다시 CasRx와 dCasRx 단백질의 유비쿼터스 발현에 의해 특별히 유도된 독성을 건의하는 멘델리안 유전학을 따랐습니다. CRISPR/Cas 시스템의 독성은 새로운 것이 아닙니다. Cas9 단백질의 다량은 flies29,30,31,32를 포함하여 몇몇 유기체에서 유독한 것으로 나타났습니다. 최근 연구는 UAS-Cas9 construct33에서 UAS 서열과 Cas9 서열 사이의 다양한 길이의 개방 독서 프레임을 추가하여 파리에서 발현된 Cas9 단백질의 양을 조정할 수 있는 맞춤형 GAL4/UAS 시스템을 개발했습니다. 따라서 CasRx 단백질 발현 수준을 조정하여 CasRx 유도 독성을 줄이는 방법을 모색할 필요가 있습니다.
CasRx 및 dCasRx 단백질의 유비쿼터스 발현에 의해 유도된 독성 이외에, 결과는 또한 CasRx 시스템의 비특이적 부수적 인 오프 표적 효과에 연결된 치사성, 많은 CRISPR 시스템의 특징1,2,7,34를 보였다. CasRx 및 비 필수 유전자 gRNA 발현 이중 또는 삼중 환화구우스 파리, 예를 들어 노치를 대상으로 할 때, transheterozygous CasRx 파리는 transheterozgyous dCasRx 파리에 비해 생존율의 상당히 낮은 수준을 갖는다. 이들 CasRx 및 gRNA 발현 트랜게테로지구우스의 RNA-seq 분석에서 표적 유전자 전사량의 감소와 비표적 유전자 전사체의 감소가 모두 관찰되었다. 이러한 부수적 효과는 CasRx에 의존적이고 표적에 의존적이었으며, CasRx 단백질과 gRNA를 모두 표현하는 트랜스페테로지구우스 파리에서만 관찰되었습니다. 표적 유전자 중 하나인 흰색은 백색 유전자가 명확한 색소 감소 표현형과는 대조적으로 CasRx에 의해 표적으로 삼았을 때 성적증명서의 제한적, 비통계적으로 유의한 감소만을 보였다는 점을 지적할 가치가 있습니다. 이는 1) RNA-seq 샘플 수집의 타이밍이 백색 유전자가 초기 발달 시 피크 발현에 도달할 때타이밍과 잘 맞지 않았기 때문일 수 있으며, 2) 눈내 백색 유전자의 국소화된 발현은 전바디 샘플 수집만 가능할 때 초기 개발 단계에서 관련 조직을 수집하는 데 어려움을 겪고 있다. CasRx 시스템의 부수적 활동을 줄이기 위해, 미래의 연구는 유기체 수준에서 오프 타겟 현상 시스템의 근본적인 메커니즘을 완전히 이해하도록 요구됩니다.
흥미롭게도, 최근 연구35 파리에서 RNA 표적 Cas13 도구를 설명하는 것은 몇 가지 가능한 이유로 CasRx 발현과 관련된 일반적인 독성을 개량하는 것으로 나타났다. 첫째, 저자는 Drosophila 에서 표현을 최적화하기 위하여 Cas13 전염을 재코딩하고 본 연구 결과에서 사용된 유비퀴틴 프로모터에 비해 더 약한 표현 프로모터 (actin 5C)를 이용하고, 가능성이 Cas13 발현의 낮은 수준으로 이끌어 내고 따라서 더 적은 독성으로 이끌어 냅니다. 실제로, 이것은 UASt 중심의 CasRx및 dCasRx 발현이 이 연구 결과 (그리고 35의 저자)가 UASt-CasRx 파리에 있는 어떤 명백한 치사도 관찰하지 않았기 때문에, 그 자체로, 유독하지 않았다는 관측에 의해 지원됩니다. 더욱이, 이 저자는 그들의 발현에 영향을 미쳤을 지도 모르다 이 연구 결과에 비하여 그들의 gRNA를 다르게 인코딩하고 transheterozygous Cas13/gRNA 파리에 있는 시스템의 독성을 감소시켰습니다. 예를 들어, 연구에서 2gRNA는 U6:3 프로모터를 사용하여 발화되었고 TRNA에 의해 측면화되어 CasRx35를 요구하지 않고 tRNA 성숙시 gRNA 처리를 가능하게 했다. 반대로, 이 연구에서 gRNA는 유전자당 최대 4개의 위치를 대상으로 하는 어레이로 인코딩되었으며 박테리아에서 발견되는 내인성 Cas13 어레이 구조를 모방하여 각 gRNA를 처리하는 Cas13 효소를 필요로 합니다. 이러한 다른 접근은 gRNA 발현 수준 및 전체 시스템의 독성에 내재된 영향을 미칠 수 있는 그밖 요인에 있는 다름으로 이끌어 내수 수 있습니다. 마지막으로, Huynh 외. 대상-Cas/gRNA 상호 작용 및 부수적 활동에 차이 귀착되 고 치사의 관찰 된 수준에 영향을 미칠 수 있습니다 본 연구에서 대상 보다 다른 유전자를 대상으로. 관찰된 독성의 이러한 차이는 전체 시스템을 개선할 수 있는 방법을 확인하기 위해 추가 조사를 보증합니다.
전반적으로, 본 연구는 D. 멜라노가스터에서 기능적 유전적으로 인코딩된 프로그래밍 가능한 RNA 표적 Cas 시스템의 첫 번째 데모이며, CasRx 시스템의 추가 최적화(보고된 내용35에 따라)는 오프 타겟 관련 치사성을 더욱 감소시키고 표적 분열에 대한 CasRx의 효능을 증가시키는 데 필요할 것이다. Cas 효소를 가진 RNA 표적화는 곤충 벡터 제어에서 치료 사용에 이르기까지 많은 잠재적 인 응용 분야를 가진 급속하게 진화하는 분야입니다1,2,3,4,5,6,7, 이 프로토콜은 파리의 첫 번째 CasRx 시스템을 설계하는 데 관심이있는 사람을위한 스타터 패키지를 제공하며 시스템의 사용자 정의 및 추가 최적화와 호환됩니다. 여기에 제시된 예제에서는 이 시스템을 생체 내에서 구현하는 동안 발생할 수 있는 다양한 결과를 보여 주며 응용 프로그램에서 CasRx 시스템의 성능을 평가하는 다른 사용자의 벤치마크 역할을 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 DARPA 세이프 유전자 프로그램 보조금(HR0011-17-2-0047)과 NIH 어워드(R21RAI149161A, DP2AI152071)의 자금 지원을 받았습니다.
100% Grape Juice | Welch Foods Inc. | N/A | |
Active Dry Yeast (908g) | Red Star Yeast Company, LLC | N/A | |
DMC4500 color camera | Leica Microsystems | DMC4500 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
GAL4-GMR flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 29967 | |
GAL4-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 44373 | |
Glomax 20/20 Luminometer | Promega | E5331 | |
Illumina HiSeq2500 Sequencer | Illumina, Inc. | HiSeq2500 | |
M165FC fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | M165FC | |
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer | ThermoFisher | NDONEC-W | |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit | New England Biolabs, Inc. | E7770 | |
plasmid # 112686 | Addgene | 112686 | |
plasmid # 112688 | Addgene | 112688 | |
plasmid # 132416 | Addgene | 132416 | |
plasmid # 132417 | Addgene | 132417 | |
plasmid # 132419 | Addgene | 132419 | |
plasmid # 132420 | Addgene | 132420 | |
plasmid # 132421 | Addgene | 132421 | |
plasmid # 132422 | Addgene | 132422 | |
plasmid # 132425 | Addgene | 132425 | |
plasmid # 132426 | Addgene | 132426 | |
plasmid # 133304 | Addgene | 133304 | |
plasmid # 164586 | Addgene | 164586 | |
plasmid #132418 | Addgene | 132418 | |
plasmid pJFRC81 | Addgene | 36432 | |
Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Restriction endonucleases AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | |
Restriction endonucleases NotI | New England Biolabs Inc. | R0189L | |
Restriction endonucleases PacI | New England Biolabs Inc. | R0547L | |
Restriction endonucleases PstI | New England Biolabs Inc. | R0140L | |
Restriction endonucleases SwaI | New England Biolabs Inc. | R0604L | |
Restriction endonucleases XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145L | |
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Turbo DNase | Invitrogen | AM2238 | |
U6-3:4-gRNA-Fluc flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84125 | |
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84986 | |
U6-3:4-gRNA-N flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84122 | |
U6-3:4-gRNA-w flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84124 | |
U6-3:4-gRNA-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84123 | |
UASt-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84121 | |
UASt-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84120 | |
Ubiq-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84118 | |
Ubiq-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84119 | |
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84127 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits | Zymo Research Corporation | D4007 |