Denna artikel beskriver ett detaljerat protokoll för att använda RNA-targeting Cas13D enzym (RfxCas13D) i flugor.
CasRx, en medlem av RNA-inriktade Cas13-familjen, är ett lovande nytillskott av CRISPR / Cas-teknikerna i effektiv genutskriftsreduktion med en attraktiv off-target-profil på både cellulära och organismala nivåer. Det rapporteras nyligen att CRISPR/CasRx systemet kan användas för att uppnå allestädes närvarande och vävnad-specifika gen transkription minskning i Drosophila melanogaster. Detta dokument beskriver metoderna från det senaste arbetet, bestående av tre delar: 1) allestädes närvarande in vivo endogen RNA-inriktning med hjälp av ett tvåkomponent CasRx-system; 2) Allestädes närvarande in vivo exogent RNA-mål med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. och 3) vävnadsspecifik in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. Effekterna av RNA inriktning observeras inkluderar riktade genspecifika fenotypiska förändringar, riktade RNA transkript minskning och tillfällig dödlighet fenotyper i samband med högt uttryck av CasRx protein och säkerheter verksamhet. Sammantaget visade dessa resultat att CasRx-systemet kan rikta RNA-transkriptreduktion på organismnivå på ett programmerbart och effektivt sätt, vilket visar att in vivo transcriptome-inriktning och teknik är genomförbar och lägger grunden för framtida in vivo CRISPR-baserade RNA-inriktningstekniker.
Sedan tillkomsten av Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) teknik, mycket av fokus inom detta område har varit på DNA-redigering, som erbjuder transformativa tillämpningar inom medicin och bioteknik1. Permanent förändring av DNA-sekvenser är dock inte alltid önskvärd på grund av etiska överväganden. Mot bakgrund av detta började nyligen genomförda studier utveckla CRISPR-baserade verktyg för att rikta in sig på RNA och visade att CRISPR-teknik verkligen kan användas för RNA-inriktning i en mängd olika biologiska system2,3,4,5,6,7. I många av dessa testade system är den nuvarande allmänt använda metoden för att rikta in sig på RNA och transkriptreduktion RNA-interferens (RNAi), vilket är långt ifrån perfekt, ofta uppvisar varierad effekt och hög off-target-aktivitet när den används i vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Med tanke på statusen för dessa tekniker är det därför värt att ytterligare undersöka potentialen hos CRISPR-baserade verktyg för RNA-inriktning.
En anmärkningsvärd ny studie rapporterade att ribonukleas CasRx, en medlem av Cas13d-klassen, effektivt kan minska genutskriftsnivåer i mänsklig cellkultur och har en attraktiv off-target profil4. Detta konstaterande ledde till frågan om denna nya ribonukleas kan bibehålla sin effekt och låga off-target frekvens för RNA-inriktning på organismnivå. En nyligen genomförd studie tog upp denna fråga genom att visa att CasRx-systemet kan användas för att uppnå allestädes närvarande och vävnadsspecifik genutskriftsreduktion i Drosophila melanogaster5.
För att effektivisera användbarheten av denna nyligen publicerade metod beskriver detta protokoll metoderna från detta senaste arbete, som består av tre huvuddelar: 1) allestädes närvarande in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett tvåkomponent CasRx-system; 2) Allestädes närvarande in vivo exogent RNA-mål med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. och 3) vävnadsspecifikt in vivo RNA-mål med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter.
Vägleda RNAs (gRNA) som uppsätta som målgener under kontrollera av en allestädes närvarande promotor planlades, och fluga fodrar att uttrycka dessa gRNA-innehållande konstruktioner genererades. CasRx konstruktioner under kontroll av antingen en allestädes närvarande promotor, eller en villkorlig uppströms aktiveringssekvens (UASt) promotor som kan aktiveras av GAL4 transkriptionsfaktorn, utformades också och fluglinjer som hyser dessa CasRx-innehållande konstruktioner genererade. Katalytiskt inaktiva CasRx konstruktioner, dCasRx, utformades och användes som negativa kontroller. Allestädes närvarande RNA-inriktning i flugor uppnås genom att korsa gRNA-uttryckande flyglinjer med allestädes närvarande CasRx-uttryckande flyglinjer. Avkomman som uttrycker både gRNA-konstruktionen som riktar sig mot en specifik genutskrift och CasRx-proteinet har en allestädes närvarande minskning av riktade genutskrifter. Vävnadsspecifik RNA-inriktning i flugor uppnås genom att först korsa gRNA-uttryckande flugor med UASt-CasRx uttrycker flugor, erhålla transheterozygous flugor som bär både gRNA och UASt-CasRx konstruktioner. Sådana flugor korsas i sin tur med vävnadsspecifika GAL4-uttryckande flugor, vilket resulterar i generering av vävnadsspecifikt CasRx-uttryck och RNA-inriktning hos flugor.
CasRx-systemets programmerbara karaktär erbjuder möjligheten till anpassning och optimering för att uppnå hög effektivitet och låg off-target-aktivitet för in vivo RNA-inriktning. Potentiella tillämpningar av CRISPR-baserad RNA-inriktning är många, inklusive att ersätta RNAi i laboratoriet och bidra till insektsvektorkontroll i naturen. Av de senare är ett av de globala ouppfyllda behoven utvecklingen av effektiva verktyg för att bekämpa infektioner av RNA-virus som överförs via myggor. Många RNA-virus, såsom denguefeber, Zika och chikungunyavirus, överförs via myggor, vilket påverkar människors hälsa och bidrar till dödlighet. Många förslag för att konstruera myggpopulationer med virusresistens för förebyggande av sjukdomar har lagts fram; Emellertid, ingen strömteknologi är kompetent att göra myggor samtidigt resistent till alla viktiga RNA-virus18.19.20.21.22.23. RNA-inriktade Cas-system kan utgöra en utgångspunkt för en sådan teknik genom att möjliggöra en programmerbar plattform för att rikta in sig på alla myggburna RNA-virus.
Med tre olika applikationsdesigner av CasRx-systemet visade detta arbete i vivoprogrammable RNA-inriktning i flugor. De olika strategierna tillgodoser olika projektbehov, såsom endogen kontra exogen geninriktning och allestädes närvarande kontra vävnadsspecifik RNA-inriktning. Effekterna av RNA inriktning ingår mål gen specifika fenotypiska förändringar, mål RNA transkript minskning och tillfällig dödlighet fenotyper i samband med högt uttryck av CasRx protein och säkerheter verksamhet. Sammantaget visade dessa resultat att CasRx-systemet kan rikta RNA-transkriptreduktion på organismnivå på ett programmerbart och effektivt sätt.
En av de viktigaste faktorerna för framgångsrik anpassning av CasRx-systemet är utformningen av gRNAs. Specifikt ska följande råd beaktas: målsekvensen är cirka 30 nukleotider i längd, längden på poly-U-sträckor i målsekvensen är 4 baspar eller mindre, målsekvensen GC-halten ligger i intervallet 30% – 70%, målsekvensen förutspås inte bilda starka RNA-hårnålsstrukturer och målsekvensen innehåller minimal förutsedd RNA sekundär eller tertiär struktur5.
Förutom gRNA-designerna är flyggenetiksteget i varje protokoll också avgörande för en framgångsrik implementering. Förekomsten eller bristen på de definierade fenotyper som överförs från föräldrarna i avkomman är viktiga för att identifiera och kvantifiera fenotyper som induceras av CasRx-systemet i transheterozygous avkomman. Att ställa in kontrollkors med dCasRx flugor parallellt är också till hjälp i de uteslutande icke-specifika fenotyperna i transheterozygous avkomman.
Det är värt att notera att dessa resultat avslöjade toxicitetsproblem som infördes genom att allestädes närvarande uttrycka CasRx och dCasRx-protein i flugan, en begränsning av CasRx-systemet. Allestädes närvarande uttryck av CasRx eller dCasRx enbart under Ubiq promotor, utan gRNAs, kom med icke-triviala fitness kostnader, eftersom varken Ubiq-CasRx eller Ubiq-dCasRx flugor kunde fastställas som homozygous linjer. Tvärtom kan UASt-CasRx- och UASt-dCasRx-flugor fastställas som friska homozygösa bestånd, men på grund av utformningen av korssystemet hölls de som dubbelbalanserade bestånd, ett faktum som stöder förekomsten av toxicitet som framkallas av allestädes närvarande CasRx proteinuttryck. Ett annat stödjande bevis är att i kontrollexperiment med dCasRx, som är katalytiskt inaktivt, var andelen flugor som transporterar både dCasRx och gRNA-konstruktioner av det totala antalet flugor i F1-generationen genomgående lägre än 50%, det förväntade förhållandet baserat på mendeliangenetik om ingen dCasRx-associerad toxicitet var närvarande. Detta indikerade att allestädes närvarande uttrycker dCasRx, tillsammans med gRNAs, inducerar toxicitet i flugan, vilket resulterar mindre än förväntat arv förhållande. Arvskvoterna av transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 flugor följde Mendelian genetik, som återigen föreslår toxicitet framkallas specifikt av allestädes närvarande uttryck av CasRx och dCasRx proteiner. Toxicitet i CRISPR/Cas-systemet är inte nytt. Stora mängder Cas9-protein har visat sig vara giftigt i flera organismer, inklusive flugor29,30,31,32. En ny studie har utvecklat ett anpassat GAL4/UAS-system som kan justera mängden Cas9-protein uttryckt i flugor genom att lägga till en öppen avläsningsram av varierande längd mellan UAS-sekvensen och Cas9-sekvensen i UAS-Cas9-konstruktionen33. Därför är det värt att utforska sätt att minska CasRx-inducerad toxicitet genom att justera CasRx proteinuttrycksnivå.
Förutom toxiciteten som framkallas av allestädes närvarande uttryck av CasRx- och dCasRx-proteiner, visade resultaten också dödlighet kopplad till CasRx-systemets icke-specifika effekter utanför målet, en egenskap hos många CRISPR-system1,2,7,34. I några av CasRx och icke-essentiella gen gRNA-uttrycka dubbla eller trippel transheterozygous flugor, till exempel när man riktar in sig på Notch, har de transheterozygous CasRx flugorna betydligt lägre överlevnadsnivåer jämfört med de transheterozgyous dCasRx flugor. I RNA-seq analysen av dessa CasRx och gRNA-uttrycka transheterozygous flugor, både minskningen av mål gen transkription nivåer och minskningen av icke-mål gen transkriptioner observerades. Dessa sidoeffekter var CasRx-beroende och målberoende, eftersom de endast observerades i transheterozygous flugor som uttrycker både CasRx proteinet och gRNA. Det är värt att påpeka att en av målgenerna, vit, visade endast en begränsad, icke-statistiskt signifikant minskning av transkriptioner när den vita genen riktades mot CasRx, vilket stod i kontrast till den tydliga pigmentreduktionsfenotypen. det är hypotesen att detta kan bero på det faktum att 1) tidpunkten för RNA-seq provsamling inte var väl i linje med tidpunkten när den vita genen når sitt topputtryck under tidig utveckling, och 2) det lokaliserade uttrycket av den vita genen i ögonen gör det utmanande att samla relevanta vävnader under tidig utveckling fas när endast hela kroppen prov samling är genomförbar. För att minska den indirekta aktiviteten i CasRx-systemet krävs framtida studier för att fullt ut förstå de mekanismer som ligger till grund för fenomenet utanför målet på organismnivå.
Intressant nog verkade en ny studie35 som beskriver RNA-inriktning Cas13 verktyg i flugor att lindra den allmänna toxiciteten i samband med CasRx uttryck, av flera möjliga skäl. För det första omkodade författarna Cas13-transgenerna för att optimera uttrycket i Drosophila och använde en mer svagt uttryckande promotor (aktin 5C) jämfört med den ubiquitinpromotor som används i den nuvarande studien, vilket sannolikt leder till lägre nivåer av Cas13-uttryck och därmed mindre toxicitet. Detta stöds i själva verket av observationerna att UASt-drivna CasRx- och dCasRx-uttryck inte i sig var giftigt, eftersom denna studie (och författarna i 35) inte observerade någon uppenbar dödlighet hos UASt-CasRx-flugor. Dessutom kodade dessa författare sina gRNAs annorlunda jämfört med denna studie, vilket kan ha påverkat deras uttryck och minskat systemets toxicitet i transheterozygous Cas13/gRNA flugor. Till exempel uttrycktes i sin studie två gRNAs med hjälp av U6:3 promotorn och flankerades av tRNAs för att möjliggöra gRNA-bearbetning vid tRNA-mognad utan att kräva CasRx35. Omvänt, i denna studie, gRNAs kodades som matriser som riktar sig upp till 4 platser per gen och härma den endogena Cas13 matrisstrukturen som finns i bakterier, vilket kräver Cas13 enzymet att bearbeta varje gRNA. Dessa olika tillvägagångssätt kan ha lett till skillnader i gRNA-uttrycksnivåer och andra faktorer som kan ha inneboende effekter på toxiciteten i hela systemet. Slutligen riktade Huynh m.fl. in sig på andra gener än de som var riktade i den aktuella studien, vilket resulterar i skillnader i target-Cas/gRNA-interaktion och sidoaktivitet och kan ha effekter på de observerade nivåerna av dödlighet. Dessa skillnader i observerad toxicitet motiverar ytterligare undersökningar för att identifiera sätt att förbättra de övergripande systemen.
Sammantaget är denna studie den första demonstrationen av ett funktionellt genetiskt kodat programmerbart RNA-riktat Cas-system i D. melanogaster, om än ytterligare optimering av CasRx-systemet (i linje med vad som rapporteras35) kommer att krävas för att ytterligare minska den off-target-associerade dödligheten och öka effekten av CasRx på-mål klyvning. RNA-inriktning med Cas-enzymer är ett snabbt föränderligt fält med många potentiella tillämpningar som sträcker sig från insektsvektorkontroll till terapeutiska användningar1,2,3,4,5,6,7, och detta protokoll erbjuder ett startpaket för alla som är intresserade av att designa sitt första CasRx-system i flugor, samtidigt som det är kompatibelt med anpassning och ytterligare optimering av systemet. Exemplen som presenteras här visar en rad resultat som man kan stöta på under genomförandet av detta system in vivo och kan fungera som riktmärken för andra användare vid utvärdering av CasRx-systemets prestanda i sina applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av finansiering från ett DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) och NIH-utmärkelser (R21RAI149161A, DP2AI152071) som tilldelats O.S.A.
100% Grape Juice | Welch Foods Inc. | N/A | |
Active Dry Yeast (908g) | Red Star Yeast Company, LLC | N/A | |
DMC4500 color camera | Leica Microsystems | DMC4500 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
GAL4-GMR flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 29967 | |
GAL4-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 44373 | |
Glomax 20/20 Luminometer | Promega | E5331 | |
Illumina HiSeq2500 Sequencer | Illumina, Inc. | HiSeq2500 | |
M165FC fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | M165FC | |
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer | ThermoFisher | NDONEC-W | |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit | New England Biolabs, Inc. | E7770 | |
plasmid # 112686 | Addgene | 112686 | |
plasmid # 112688 | Addgene | 112688 | |
plasmid # 132416 | Addgene | 132416 | |
plasmid # 132417 | Addgene | 132417 | |
plasmid # 132419 | Addgene | 132419 | |
plasmid # 132420 | Addgene | 132420 | |
plasmid # 132421 | Addgene | 132421 | |
plasmid # 132422 | Addgene | 132422 | |
plasmid # 132425 | Addgene | 132425 | |
plasmid # 132426 | Addgene | 132426 | |
plasmid # 133304 | Addgene | 133304 | |
plasmid # 164586 | Addgene | 164586 | |
plasmid #132418 | Addgene | 132418 | |
plasmid pJFRC81 | Addgene | 36432 | |
Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Restriction endonucleases AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | |
Restriction endonucleases NotI | New England Biolabs Inc. | R0189L | |
Restriction endonucleases PacI | New England Biolabs Inc. | R0547L | |
Restriction endonucleases PstI | New England Biolabs Inc. | R0140L | |
Restriction endonucleases SwaI | New England Biolabs Inc. | R0604L | |
Restriction endonucleases XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145L | |
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Turbo DNase | Invitrogen | AM2238 | |
U6-3:4-gRNA-Fluc flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84125 | |
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84986 | |
U6-3:4-gRNA-N flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84122 | |
U6-3:4-gRNA-w flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84124 | |
U6-3:4-gRNA-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84123 | |
UASt-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84121 | |
UASt-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84120 | |
Ubiq-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84118 | |
Ubiq-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84119 | |
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84127 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits | Zymo Research Corporation | D4007 |