I denne protokollen beskriver vi hvordan du genererer murine primære epitelale kolonmonolayere direkte fra tarmkrypter. Vi tilbyr eksperimentelle tilnærminger for å generere samtidige monolayers på gjennomtrengelige filtre, konfluente monolayers for riper sår healing og biokjemiske studier, og sparsomme og konfluente monolayers for immunfluorescence analyse.
Intestinal epitel består av et enkelt lag av celler som fungerer som en barriere mellom tarmlumen og kroppens indre. Forstyrrelser i kontinuiteten i denne barrieren kan føre til inflammatoriske lidelser som inflammatorisk tarmsykdom. En av begrensningene i studiet av intestinal epitelbiologi har vært mangelen på primærcellekulturmodeller, som har forpliktet forskere til å bruke modellcellelinjer avledet fra karsinomer. Adventen av tredimensjonale (3D) enteroider har gitt epitelbiologer et kraftig verktøy for å generere primærcellekulturer, likevel er disse strukturene innebygd i ekstracellulær matrise og mangler modenhetskarakteristikken til differensierte tarmepiteleceller. Flere teknikker for å generere intestinale epitel monolayers har blitt publisert, men de fleste er avledet fra etablerte 3D-enteroider som gjør prosessen arbeidskrevende og dyr. Her beskriver vi en protokoll for å generere primære epitelale kolonmonolayere direkte fra murine intestinale krypter. Vi beskriver også eksperimentelle tilnærminger som kan brukes med denne modellen, for eksempel generering av konfluente kulturer på gjennomtrengelige filtre, sammenfallende monolayer for ripesårhelingsstudier og sparsomme og sammenfallende monolayers for immunfluorescence analyse.
Intestinale epitelceller (IEC) linje tarmene danner en selektivt gjennomtrengelig barriere som tillater nærings- og vannabsorpsjon samtidig som mikroorganismer og giftstoffer kommer inn i kroppen 1. Tarmslimhinnen består av lysende projeksjoner kalt villi (bare tilstede i tynntarmen) og invaginasjoner kalt krypter. Villi og overflaten av kolonkrypter er dekket av differensierte epitelceller mens bunnen av kryptene består av stamceller som gjør rask fornyelse av tarmepitelet, som har en omsetning fra 3 til 7 dager. Intestinale stamceller (ISC) er ikke bare viktige for å opprettholde tarm homeostase, men for tilstrekkelig reparasjon av skadet epithelia2.
Studie av tarmepilesibiologien var begrenset av mangelen på primærcellekulturer med transformerte cellelinjer som det eneste verktøyet som var tilgjengelig. Intestinal epitelial modellcellelinjer er ikke i stand til å nøyaktig gjenskape fysiologien til det normale tarmepitelet. Utviklingen av 3D-kulturer avledet fra ISC ga tarm slimhinnebiologer med in vitro-modeller som ligner i vivo tarm slimhinneforhold3. Krypter kan lett isoleres fra murinprøver, innebygd i et kjellermembranmatrisemedium (f.eks. matrigel) og dyrkes i betingede medier som inneholder Wnt3a, R-spondin og Noggin, og genererer 3D-strukturer kjent som enteroider (tynntarmen) eller kolonoider (tykktarmen)4. Enteroider og kolonoider er polariserte sfæroidale strukturer der det apikale domenet står overfor en intern lumen og basolateralområdet er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrisen. Enteroider og kolonoider inneholder alle store differensierte intestinale epiteliale undertyper som Enterocytes / Colonocytes, Paneth, Enteroendocrine og Goblet celler, og de vises i relativt samme proporsjoner som de gjør i den delen av tarmen der de ble isolert fra5. Selv om 3D-enteroider og kolonoider representerer et stort fremskritt i studiet av tarmutvikling og fysiologi, presenterer disse modellene visse ulemper som begrenset tilgang til epitelcellens apikale overflate (lumen) og evnen til å skalere kulturer opp eller ned for å oppnå høygjennomstrømningsscreening av molekyler av interesse. For å overvinne disse begrensningene ble protokoller for å oppnå primære 2D-kulturer av IEC avledet fra 3D-enteroider / kolonoider generert. 2D-enteroider/kolonoider vokser som ark med celler akkurat som modellcellelinjer gjør og er ideelle for å studere blant annet tarmsårreparasjon, vertspatogeninteraksjoner og regenerativ medisin. Flere publiserte artikler beskriver hvordan man genererer 2D-monolayere fra 3D-strukturer eller direkte fra tarmkrypter, (se6,7,8,9,10,11), men disse metodene har en tendens til å være arbeidskrevende og vanskelig å reprodusere. En rask, enkel og reproduserbar metode for å oppnå monolayers direkte fra nyisolerte tarmkrypter for mus er skissert i denne protokollen.
Her forklarer vi i detalj prosessen for kryptutvinning med minimal generering av rusk, ekstracellulært matrisevalg og forskjellige overflater og applikasjoner for denne teknikken. Denne eksperimentelle tilnærmingen ble optimalisert for kolonkrypter, men lignende resultater oppnås når de brukes på tynntarmen.
Vår protokoll gir en rask, reproduserbar og pålitelig metode for å generere direkte primære 2D IEC monolayers. En av de viktigste forskjellene i vår protokoll sammenlignet med tidligere publiserte protokoller for å generere kolon epiteliale monolayers er at vi ikke kutter tykktarmen i små biter for å frigjøre kryptene. I stedet tilpasset vi en protokoll for å skille intestinal epitel fra mesenchyme13 ved en kombinasjon av kjemiske og mekaniske krefter for å frigjøre krypter i et ekstremt rent preparat, (Figur 2), noe som gir forskeren ideelt materiale for å generere primærkulturer. Vår isolasjonsmetode kan også brukes til å generere 3D-enteroider og kolonoider. Det er viktig å gjøre et kryptantall hver gang et eksperiment utføres for å normalisere antall krypter som blir belagt. Variabler som kolonpølse turgor, isolasjonshastighet, brukerekspertise kan påvirke antall krypter isolert. Den foreslåtte platingkryptkonsentrasjonen som er nevnt i protokollen, er et utgangspunkt, men hver bruker som skal ta hensyn til brukerdrevne variabler, må optimalisere den. Vi har brukt denne teknikken med mannlige og kvinnelige WT-mus fra 8 til 20 uker, og vi har ikke sett store forskjeller i celleoverlevelse, i teorien har krypter isolert fra yngre mus bedre sjanser til å overleve. Krypter er belagt i overkant, da bare en liten prosentandel av dem festes til overflaten og overlever. En balanse der det er nok krypter til å ha en 50% samløp en dag etter plating, men ikke for mange krypter der de døende kryptene vil ha en cytotoksisk effekt er målet. LWRN-medier må fjernes forsiktig 24 timer etter plating for å eliminere døde krypter og rusk, dette må gjøres nøye for å unngå å løsne celler som allerede vokser som monolayer.
Etter første fjerning av LWRN-medier må brukeren avgjøre om de eksperimentelle forholdene krever primære IEC-monolag som forblir nærmere stamceller og legger til friske LWRN-medier, eller om differensiering av monolayeren er ønsket, erstatt med differensieringsmedier. Den viktigste faktoren i denne protokollen er å sikre kolonets integritet under isolasjonsprosessen. Hvis det oppstår et brudd, kan pølsen forkortes for å eliminere det skadede området. Før du setter pølsen i EDTA, må du sørge for at knutene er så stramme som mulig. Hvis pølsen deflateres etter EDTA-inkubasjonen, kan protokollen fortsette med liten eller ingen effekt i det totale kryptutbyttet. Hvis den gjentatte sprøyten ikke er tilgjengelig, kan en vanlig mikropipettespiss festet til en vanlig sprøyte også brukes til prosessen med inflasjon og deflasjon. Også, hvis ingen celle utvinning løsning er tilgjengelig, kan inflasjon og deflasjon trinn gjøres i EDTA (2mM tynntarmen, 50 mM kolon), men denne substitusjonen anbefales ikke. Hvis samløp ikke er nødvendig, kan krypter vokse i plater belagt bare med kollagen og til og med i ubestrøket plater. Bruk bare ubestrøkete plater tilfeller det er ikke noe annet alternativ, men cellene vil ikke vokse sunt som de ville gjort i kollagenbelagte plater. Når det gjelder kulturhelse og stabilitet, er monolayers belagt i plast sunt i 4 til 5 dager, mens monolayers belagt i transwells kan bæres i opptil 8 dager.
En av hovedbegrensningene ved denne metoden er cellemediet som kreves for å dyrke epitelale kolonmonolayere. LWRN-celler er tilgjengelige ved ATCC, men LWRN-betinget mediegenerering er arbeidsintensiv og krever tilgang til et fluorescerende spektrometer for å bestemme Wnt-aktivitet. Differensieringsmedier krever en rekke reagenser som legges til friske før bruk, noe som gjør det til en kjedelig prosess. Til slutt er de fleste av disse reagensene kostbare og er enkle å brenne reagensene i et raskt tempo. Hvis et laboratorium ønsker å etablere denne teknikken uten tidligere tarm primærcellekultur, anbefales det på det sterkeste å finne en samarbeidspartner / høyskole med erfaring og trene et av sine medlemmer.
Vedlikehold av 3D-kultur kan være dyrt på grunn av kostnadene for kjellermembranmatrisemedium og høye mengder betingede medier som trengs for organoidkulturer, men det har fordelen av å bruke et redusert antall mus og de genererte strukturene kan passeres mange ganger. Enteroider (avledet fra tynntarmen) er relativt enkle å isolere og vedlikeholde mens kolonoider er mer delikate, vokser i et langsommere tempo og har en mer begrenset passasjekapasitet. Monolayergenerering fra 3D-kolonoider krever en uforholdsmessig stor mengde 3D-strukturer, noe som gjør denne typen eksperimenter tidkrevende og kostbare. Tvert imot er direkte epitelial kolon monolayer prep rask og er en rask måte å oppnå resultatene på. En kolonforberedelse kan generere et sammenløpsområde på 75 cm2 (10 til 15 ml betingede medier, erstatter en gang) 2 til 3 dager etter plating (dette området vil kreve 144 brønner med 3D-kolonoider, noe som betyr nesten 6 ml Matrigel og mer enn 250 ml betingede medier). Det lavere forbruket av medier, rimelig vedlikehold av cellekulturen og evnen til å utføre funksjonelle tester og rask nedstrøms prosessering er store fordeler med epitelale kolonmonolayers.
Denne protokollen er et verdifullt verktøy i studiet av intestinal epitelcellebiologi i områder som celleadhesjon, polaritet og differensiering. Det gir fordelen å generere primære cellekulturer fra genetisk modifiserte mus (knock-out, overexpressing, reportere). De primære intestinale epitelale monolayers gir enkel tilgang til de apikale og basolaterale overflatene (når de er belagt på transwells) slik at studiet av permeabilitet, barriere og transepithelial migrasjon av forskjellige celletyper. Til slutt kan denne modellen være nyttig i forskjellige felt som vertspatogeninteraksjoner, epitelskade og reparasjon og legemiddeloppdagelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Crohn’s and Colitis Foundation Career Development Award (544599, til MQ) og NIH-tilskuddene (DK055679, DK089763, DK059888, til AN). Vi vil gjerne takke Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory for deres kontinuerlige hjelp og tilgang til deres reagenser og protokoller.
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
Noggin | Conditioned media | – | |
Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |