이 프로토콜의 목적은 Drosophila 난소에서 세포 극체 구조의 국소화 및 역학에 산화 손상의 효력을 시각화하기 위하여 살아있는 화상 진찰을 사용하는 것입니다.
Drosophila 멜라노가스터 난소의 라이브 이미징은 리보뉴클레오단백질 입자 운동, mRNA 국소화, 세포간 운동 및 세포 골격 역학을 포함하여 개발 중 다양한 기본 세포 과정을 이해하는 데 중요한 역할을 해 왔습니다. 개발 된 라이브 이미징을위한 몇 가지 방법이 있습니다. 각 방법은 미디어 또는 할로카본 오일에 배치 된 개별 혈관을 해부 포함한다는 사실로 인해 저산소증 및 / 또는 물리적 조작으로 인한 세포 손상은 시간이 지남에 따라 필연적으로 발생할 수 있습니다. 저산소증의 한 다운스트림 효과는 세포내 산화 손상을 증가시키는 것입니다. 이 프로토콜의 목적은 살아있는 이미징을 사용하여 제어된 세포 손상의 유도 후 Drosophila 난소에서 세포 전세포 구조의 국소화 및 역학에 대한 산화 손상의 효과를 시각화하는 것입니다. 여기서, 우리는 과산화수소를 사용하여 세포 산화 손상을 유도하고 두 개의 세포 외 구조, 미토콘드리아 및 Clu 행복 입자에 대한 이러한 손상의 영향을 예를 제공합니다. 그러나 이 방법은 모든 세포 전 체형 구조에 적용됩니다. 제한 사항은 과산화수소는 수성 매체에만 첨가할 수 있으며 할로탄소 오일을 사용하는 이미징에는 작동하지 않는다는 것입니다. 장점은 과산화수소가 쉽게 사용할 수 있고 저렴하고, 신속하게 작용하며, 농도가 변조될 수 있으며, 산화 손상은 저산소증에 의한 손상의 좋은 근사치뿐만 아니라 조작으로 인한 일반적인 조직 손상이다.
여러 가지 세포 스트레스는 열 쇼크, 산화 스트레스, 삼투 스트레스, 영양 스트레스 및 독성 조건을 포함하여 조직 전 생체 의 실험 배양 및 조작 중에 발생할 수 있습니다. 라이브 이미징은 실험적 치료 및 조작 후 전 생체 조직의 실시간 변화를 시각화하는 데 사용되는 강력한 도구입니다. 미세 조직 해부 및 조작은 연습을 하고, 해부에서 화상 진찰에 이르는 시간의 양은 경험에 따라 달라질 수 있습니다. 이 방법을 개발하기위한 근거는 라이브 이미징을위한 조직을 준비하는 것이 해부 및 이미징 준비 중에 세포 스트레스를 일으킬 수 있다는 우려에 근거합니다. 이 세포 대사와 사용 가능한 산소 수준에 있는 변화에 민감한 프로세스에 대 한 특히 문제가 될 수 있습니다., 미토 콘 드리 아 기능 등. 병렬 야생형 시료가 중요한 대조군이지만, 세포체 구조의 일부 또는 전부 관찰된 변화는 해부로부터의 손상 또는 세포 스트레스로 인해 발생할 수 있으며 정상적인 생리학이나 치료 또는 돌연변이를 반영하지 않을 가능성이 여전히 있다.
이러한 잠재적인 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포 산화 손상을 유도하기 위해 라이브 이미징 중에 과산화수소 추가를사용합니다. 이 방법의 목적은 세포 극체 구조에 미치는 영향을 모니터링하기 위해 조직에 손상을 유도하는 것이다. 이 프로토콜은 두 가지 목적을 위해 유용하다: 1) 관심구조의 세포세포 화의 변화가 미숙한 해부에 의한 응력 때문인지 여부를 결정하고 2) 일단 연구원이 관심 구조에 대한 제어응력의 효과를 모니터링하는 해부 기술에 확신을 가지면. 여기에서 우리는 증가된 산화 손상이 두 개의 세포 외 구조물, 미토콘드리아 및 Clu 행복 입자에 있는 변경을 일으키는 원인이 되는 방법의 2개의 예를 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 살아있는 화상 진찰 연구 결과를 위한 일반적인 모형인 Drosophila 난소를 이용합니다. 첫 번째 예는 미토콘드리아 국소화를 검사합니다. 우리의 경험에서, 여성 세균 세포에 있는 일반적인 미토콘드리아 국소화는 동요에 높게 과민하고 세포 긴장의 선구자역할을 할 수 있습니다. 드로소필라 암컷 세균 세포의 미토콘드리아는 일반적으로 세포질2전체에 고르게 분산된다. 과산화수소 첨가는 세포기관이 다양한돌연변이3,4,5와유사한 방식으로 빠르게 오지역화되고 클러스터되는 원인이 된다. 두 번째 예는 Clueless(Clu)에 의해 형성된 행복 입자입니다. 클루는 세포질 전체에 확산되는 리보뉴클레오단백질이다. 그러나, 또한 최적의 세포 조건 하에서 미토콘드리아 관련 입자를형성한다 5. Clu 입자의 존재는 건강한 세포 조건에 의존하기 때문에, 우리는 그들을 “행복”입자3,5,6이라고합니다. 과산화수소의 첨가로 인해 이러한 입자가 빠르게 분산되어 세포질5에서균질화된다. 우리의 연구 과정에서, 우리는 이 세포 외 구조물의 현지화에 있는 변경을 관찰했습니다, 그러나 살아있는 화상 진찰 연구를 수행한 후에만 우리는 완전히 세포 긴장 및 미토콘드리아와 행복 입자의 지역화에 산화 손상의 효력을 이해할 수 있었습니다.
이미 설립된 또는 대체 방법에 추가된 이 프로토콜의 유용성은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 첫째, 이미징 프로토콜은 약물 첨가에 순종해야 한다. 시료가 커버슬립 아래와 할로카본 오일에 장착된 경우 이 방법은7을불가능합니다. H2O2 첨가는 산화 손상의 급속한 상승을 야기하므로, 따라서, 이 기간은 적절하지 않을 수 있습니다. 산화 손상은 저산소증의 대리자로 간주될 수 있습니다. 그러나, 특정 세포 전 성분에 대한 손상에 대한 적절한 제어로 작동하기에는 너무 가혹하거나 너무 일반화 될 수 있습니다. 마지막으로, 발달 과정을 따르는 것과 같은 마지막 시간, H2 O2첨가가 너무 강할 수 있는 이미징 실험의 경우(예를 들어 8). 농도 곡선을 테스트하면 이러한 제한을 극복할 수 있습니다.
이 프로토콜은 임의의 살아있는 화상 진찰 실험에 대한 난소 해부 및 조직 배양으로 인한 유물에 대한 제어로서 유용한 추가가 될 수 있습니다. 중요한 단계는 그밖 살아있는 화상 진찰 프로토콜을 위해 찾아낸 것과 유사합니다. Drosophila 난소 전체를 해부하는 방법을 배우는 것은 연습이 걸립니다. 그러나 이 기술은 일반적으로 적절한 해부 도구를 사용하여 상당히 빠르게 학습할 수 있습니다. 마스터하기 더 어려운 난소와 각 ovariole13을포위 근육을 제거하는 것입니다. 이것은 근육 수축이 이미지 수집을 방해하지 않도록하기 위해 수행해야합니다. 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 성공을 입증하지 않는 경우, ovariole의 끝에 있는 게르마륨은 집게와 근육 칼집에서 뽑아온 ovariole로 파악할 수 있습니다. 그러나, 이 기술은 손상될 수 있기 때문에 초기 발달 단계가 검토될 경우에 문제가 됩니다. 또 다른 중요한 단계는 H 2 O2를추가 할 때 접시 바닥에 놓여있는 오오리올을 빼내지 않는것입니다. 추가 중요한 양상은 모든 살아있는 화상 진찰에 의해 공유됩니다: 연구원은 관심의 구조가 처리의 앞에 형광으로 잘 표지된다는 것을 확인해야 합니다. 여기에 사용되는 요리(재료의 표)일반적으로 라이브 이미징에 사용됩니다; 그러나 하단에 유리 커버슬립이 있는 접시 나 슬라이드 또는 큰 유리 커버 슬립은 미디어 의 드롭을 덮을 수있는 한 작동하여 미디어 증발을 방지해야합니다. 우리는 특정 현미경을 사용하는 동안, 문제의 세포 전체 구조를 볼 수있는 충분한 배율의 목표를 가진 반전 현미경과 충분한 해상도와 이미지 캡처 속도를 가진 부착 된 카메라가 작동해야합니다.
우리의 실험실은 주로 미토콘드리아 기능에 관심이 있지만,이 방법은 핵, 세포 골격 또는 내피 망상과 같은 모든 세포 전세포 구조 또는 세포기관의 역학 및 국소화를 검사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이 메서드에는 제한이 있습니다. 과산화수소를 추가하려면 조직은 수성 매체에 있어야 합니다. 라이브 이미징을 위한 대안방법은 모델 유기체7,14에서GFP의 역동적인 움직임의 첫 번째 예를 포함하여 드로소필라 혈관증에서 많은 중요한 프로세스를 설명하는 데 중요한 역할을 해온 할로카본 오일을 사용하는 것이다. 또한, 과산화수소를 미디어에 추가하면 광범위한 산화 손상을 야기하여 조직에 대한 모욕이 너무 일반적일 수 있으며, 특히 개발을 검토하는 더 긴 실험을 위해 관심있는 세포 과정에 대해 유익할 수 있습니다. 이 급속한, 광범위하고, 돌이킬 수 없는 산화 손상 때문에 오랜 기간 동안 세포를 시각화해야 하는 실험을 수행하는 것이 가능하지 않을 수 있지만, 우리는 우리가 설명한 급성 과산화수소 처리가 화상 진찰 기간 내에 대부분의 단계에서 동일한 효과를 볼 수 있기 때문에 oogenesis의 대부분의 단계에 적용 가능하다는 것을 보았습니다. 프로토콜의 저렴한 비용과 용이성을 감안할 때, 손상에 대한 유용한 제어가 될 수 있으며 고정 및 항체 라벨링 전에 치료로도 사용될 수 있다.
우리의 손에, H2O2 치료는 우리가 다양한 Drosophila 돌연변이에서 볼 미토콘드리아 오현지화및 Clu 행복 입자 분산의 변화를 모방. 그것은 또한 우리가 실험실 학습 해부 기술에 있는 새로운 연구원을 위해 보는 결과를 모방합니다. 따라서, 이 방법은 시료 준비 와 일반적인 세포 스트레스가 미토콘드리아 오중화 및 행복 입자의 존재에 예기치 않은 이전에 설명할 수 없는 변화로 이어질 수 있음을 분명히 밝혔다. 이 기술을 앞으로 이동, 과산화수소 농도 는 더 높거나 낮은 농도를 사용하여 변조 될 수있다. 세포 효과가 낮은 농도를 사용하여 보이는 경우, 미디어를 완전한 슈나이더로 대체하여 응력 표현형이 뒤집을 수 있습니다. 카보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP), 아르세니트 또는 간단한 열 쇼크와 같은 다른 세포 스트레스는 다른 세포 외 구조물에 대한 일반적인 세포 스트레스에 유용할 수 있습니다. 전 생체 조직의 라이브 이미징은 다른 매체에서 수동 조작 및 배양을 필요로하기 때문에,이 제어는 어떤 관측이 가능한 한 정상적인 생리학에 가깝지 않도록 하는 유용한 추가가 되어야합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 일러스트, 제작 및 비디오 그래피에 대한 이미징 지원에 대한 박사 제레미 Smyth와 앤 C. 셴크에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (1R01GM127938 R.T.C.).
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |