Визуализация воздействия окислительного повреждения на drosophila яичные камеры с помощью Live Imaging

Summary

Целью данного протокола является использование живой визуализации для визуализации влияния окислительного повреждения на локализацию и динамику субклеточных структур в яичниках дрозофилы.

Abstract

Live изображения яичников Drosophila меланогастер сыграл важную роль в понимании различных основных клеточных процессов во время развития, в том числе рибонуклеопротеин движения частиц, локализации мРНК, органелл движения, и цитоскелетной динамики. Существует несколько методов живой визуализации, которые были разработаны. В связи с тем, что каждый метод включает в себя вскрытие отдельных яичников, помещенных в средства массовой информации или галоуглеродное масло, повреждение клеток из-за гипоксии и/или физических манипуляций неизбежно произойдет с течением времени. Один вниз по течению эффект гипоксии является увеличение окислительного повреждения в клетках. Целью данного протокола является использование живой визуализации для визуализации влияния окислительного повреждения на локализацию и динамику субклеточных структур в яичниках дрозофилы после индукции контролируемых клеточных повреждений. Здесь мы используем перекись водорода, чтобы вызвать клеточное окислительное повреждение и привести примеры воздействия такого повреждения на две подклеточные структуры, митохондрии и частицы блаженства Clu. Однако этот метод применим к любой субклеточной структуре. Ограничения в том, что перекись водорода может быть добавлена только в aqueous средств массовой информации и не будет работать для изображений, которые используют галоуглеродное масло. Преимущества в том, что перекись водорода легко доступна и недорога, действует быстро, ее концентрации можно модулировать, а окислительный ущерб является хорошим приближением ущерба, вызванного гипоксией, а также общего повреждения тканей в результате манипуляций.

Introduction

Несколько различных клеточных стрессоров могут возникнуть во время экспериментальной культуры и манипуляции тканями ex vivo, включая тепловой шок, окислительный стресс, осмотический стресс, питательный стресс и условия токсичности. Live imaging является мощным инструментом, используемым для визуализации изменений в тканях ex vivo в режиме реального времени после экспериментального лечения и манипуляций. Мелкие вскрытия тканей и манипуляции принимают практике, и количество времени от вскрытия до изображения может варьироваться в зависимости от опыта. Обоснование разработки этого метода основано на том, что подготовка тканей к живой визуализации может вызвать клеточный стресс во время вскрытия и подготовки изображений. Это может быть особенно проблематичным для процессов, чувствительных к изменениям клеточного метаболизма и доступных уровней кислорода, таких как митохондриальная функция. Хотя наличие параллельного образца дикого типа является важным элементом управления, по-прежнему существует вероятность того, что некоторые или все наблюдаемые изменения в субклеточных структурах могут быть вызваны повреждением или клеточным стрессом в результате вскрытия и не отражают нормальной физиологии или изучаемого лечения или мутации.

Для решения этой потенциальной проблемы мы используем добавление перекиси водорода во время живой визуализации, чтобы вызвать клеточное окислительное^{повреждение 1.} Цель этого метода состоит в том, чтобы вызвать повреждение тканей для того, чтобы контролировать влияние на подклеточные структуры. Этот протокол полезен для двух целей: 1) определение того, изменения в субклеточной локализации структуры интересов связано со стрессом, вызванным неопытным вскрытием и 2) после того, как исследователь уверен в методах вскрытия, описанных для мониторинга влияния контролируемой нагрузки на структуру интереса. Здесь мы покажем два примера того, как увеличение окислительного повреждения вызывает изменения в двух субклеточных структурах, митохондриях и частицах блаженства Clu. Для этого мы используем яичник Drosophila, который является общей моделью для живых исследований изображений. В первом примере рассматривается митохондриальная локализация. По нашему опыту, нормальная митохондриальная локализация в женских зародышевых клетках очень чувствительна к возмущениям и может выступать в качестве предвестника клеточного стресса. Митохондрии в drosophila женские зародышевые клетки, как правило, равномерно рассеяны по всей цитоплазмы². Добавление перекиси водорода приводит к тому, что органеллы быстро неправильно истолковывания и кластера таким же^{образом,чтобы различные мутации 3},^4,5. Вторым примером являются частицы блаженства, образованные Clueless (Clu). Clu является рибонуклеопротеин, который рассеивается по всей цитоплазмы; однако, он также образует митохондрии связанных частиц в оптимальных клеточных условиях⁵. Поскольку присутствие частиц Clu зависит от здоровых клеточных условий, мы назвали их “блаженство”^{частиц 3,5,6}. Добавление перекиси водорода приводит к тому, что эти частицы быстро рассеиваются и становятся однородными в цитоплазме^5. В ходе наших исследований мы наблюдали изменения в локализации обеих этих подклеточных структур, но только после проведения живых исследований изображения мы смогли в полной мере оценить влияние клеточного стресса и окислительного повреждения на локализацию и динамику митохондрий и частиц блаженства.

Полезность этого протокола как дополнения к уже установленным или альтернативным методам зависит от нескольких факторов. Во-первых, протокол изображения должен быть подотменен для добавления наркотиков. Если образец установлен под крышкой и в галоуглеродном масле, этот метод был бы не возможен⁷. Добавление H₂O₂ приводит к быстрому росту окислительного ущерба, поэтому эта шкала времени может оказаться нецелесообразной. Окислительный ущерб может рассматриваться как прокси для гипоксии; однако он может быть слишком жестким или слишком обобщенным, чтобы функционировать в качестве соответствующего контроля за ущербом для некоторых субклеточных компонентов. Наконец, для экспериментов с визуализацией, которые длятся часы, такие как эксперименты,_{следующие за процессом разработки,}добавление H 2 O₂ может быть слишком сильным (например,^8). Тестирование кривой концентрации может преодолеть это ограничение.

Protocol

1. Подготовка вскрытия и визуализации средств массовой информации ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации лучше всего подходит для этого живого эксперимента изображений содержит Drosophila СМИ Шнайдера, содержащие 15% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 0,6x Pen-Strep, и 200 мкг / мл крупного рогатого скота инсулина, впоследствии называют полный Schneider в средствах массовой информации. Выполните подготовку средств массовой информации в стерильных условиях, чтобы убедиться, что она не загрязнена. Средства массовой информации была разработана для поддержки Drosophila ovarioles в течение длительных периодоввремени 9. Добавьте 15% тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода, 0,6x Pen-Strep и 200 мкг/мл бычьего инсулина в средствах массовой информации Шнайдера. Смешайте содержимое хорошо и хранить при 4 градусов по Цельсию на ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин не растворяется полностью в средствах массовой информации Полный Шнайдер, и вы заметите осадок поселиться в нижней части трубки. Сделать aliquots средств массовой информации, будучи уверенным, чтобы оставить осадок, как это будет мешать изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может быть использовано в течение одного месяца, если хранится в aliquots при 4 градусов по Цельсию. 2. Коллекция Дрозофилы для вскрытия ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная коллекция Drosophila и процедуры вскрытия также можно найти в Weil et al.10 и Parker et al.11. Для оптимальной визуализации женских зародышевых клеток сначала приготовьте флакон, содержащий стандартную пищу из кукурузной муки и мазок влажной дрожжевой пасты, которая является консистенцией арахисового масла. Это гарантирует, что самки мух сыты и будут производить все этапы развития фолликула для визуализации. Для оптимально здоровых мух собирайте 0-1 день самок и перенесите с самцами в муху пищевой флакон, содержащий влажную дрожжевую пасту.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что спящие мухи не контакт дрожжевой пасты, как они могут придерживаться его. Кормите мух 3-7 дней, меняя флакон и дрожжевую пасту ежедневно.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что дрожжевая паста контакты летать пищи, чтобы она не высохла. 3. Рассечение яичников Дрозофилы ПРИМЕЧАНИЕ: Важно подготовить медиа-решения свежими, потому что перекись водорода подвержена окислению и TMRE ухудшается с течением времени. Прямо перед вскрытием, в средствах массовой информации Полного Шнайдера, подготовить свежий aliquot 2 МК H2O2 раствор, свежий aliquot 46 нМ тетраметхилродамин, этилэстер (TMRE), и свежий aliquot из 46 нМ TMRE решение, содержащее 2 МКМ H2O2. Для вскрытия яичников используйте две пары тонких типсов и пару электролитически заточенных вольфрамовых игл12. Чтобы вскрыть яичники, заполните 2-3 колодца стеклянного дна, рассекая блюдо (часовое стекло) с полным Шнайдером, который был разогрет до комнатной температуры. Обезболивать флакон откормленных мух углекислым газом и сегрегировать нужное количество самок мух, которые будут вскрываться. Поместите одну муху в средствах массовой информации с помощью типсов. Под рассечением микроскопа, осторожно схватить муху за грудную клетку с помощью одной пары тонких типсов. С другой парой типсов, схватить заднюю, и осторожно тянуть, чтобы удалить яичники.ПРИМЕЧАНИЕ: если яичники не выходят гладко с помощью этого метода, весь живот также может быть удален из мухи, и яичники могут быть аккуратно выдавливается из обоих концов живота с помощью миппов. Удалите посторонние кутикулы или ткани, а затем передать яичников в новый колодец, содержащий свежие средства массовой информации. Яичники должны по-прежнему движется от окружающих мышечной оболочки. 4. Подготовка яичников для визуализации Используя заточенные иглы вольфрама, осторожно дразнить ovarioles друг от друга, заботясь, чтобы удалить окружающие оболочки мышцы (Рисунок 1). Аккуратно дразнить от любой мышечной оболочки и нервных волокон, прикрепленных к изолированным яичников (Рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышечная оболочка не удаляется, ovariole будет дергаться и двигаться, вызывая проблемы с приобретением изображения (Видео 1). Если субклеточные структуры, представляющие интерес, эндогенно обозначены, переходите к шагу 4.4. Если структуры, представляющие интерес, будут помечены флуоресцентным красителем, переходите к разделу 5. После того, как ovarioles были чисто рассечены, используя микропипют, передать их в 100 йл капли полное шнайдер изображения средств массовой информации в стеклянную депрессию стеклянного дна блюдо. Индивидуальные яичники опускаются на дно капли. Перейти к разделу 6 для визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации митохондрий и частиц блаженства Clu, не более пяти-десяти минут должно проходить от начала вскрытия до визуализации. 5. Окрашивание митохондрий с TMRE ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные подробные процедуры по живому окрашиваниям митохондрий флуоресцентными красителями можно найти в Parker et al. 2017. После шага 4.3, передача изолированных яичников в 100 йл падение 46 nM TMRE средств массовой информации в стеклянную депрессию стеклянного дна блюдо. Индивидуальные яичники опускаются на дно капли. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Поместите крышку на блюдо со стеклянным дном и поместите блюдо в крытый ящик на время эксперимента, чтобы защитить от света.ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации образцы могут быть изображены непосредственно без стирки. Повторите шаги 5.1-5.2, чтобы подготовить по крайней мере два блюда из TMRE помечены ovarioles, один в качестве экспериментальной группы и один, чтобы служить в качестве контроля. 6. Приобретение изображений в реальном 2000 году После того, как яичники установлены, поместите одну из стеклянных нижней посуды на микроскоп и настроить параметры изображения по мере необходимости. Оптимальные длины волн возбуждения/выброса для TMRE, используемые здесь, 549 нм/574 нм. После обнаружения желаемого поля зрения, приобрести еще изображения или краткие видео одного или нескольких ovarioles по желанию, как запись предлечения условиях. 7. Добавление перекиси водорода во время визуализации Пауза живой визуализации, удалить крышку из стекла нижней блюдо, и тщательно добавить 100 йл из 2 МК H2O2 решение блюдо с помощью микропипюты, если изображение эндогенно помечены структуры. При визуализации митохондрий, осторожно добавьте 100 МКЛ из 46 нМ TMRE с 2 МКМ H2O2 раствор блюдо с помощью микропайетта (Видео 2). Избегайте разрушения поверхности существующей капли мультимедиа или добавления раствора слишком быстро, чтобы не вытеснять яичники, лежащие на дне блюда (Видео 2). Замените крышку блюда (крышка блюда), переместите и переориентации желаемого поля зрения, если это необходимо,и возобновить изображения (Видео 3, Видео 4, Рисунок 3, Рисунок 4). Позаботьтесь, чтобы возобновить визуализацию как можно быстрее после H2O2 дополнение, как экспериментальное лечение является чувствительным к времени (Видео 5). Приобретайте еще изображения или краткие видео одного или более ovarioles по желанию. Это послужит отчетом о послеоперационных состояниях. Для управления поместите второе стеклянное нижнее блюдо на микроскоп и повторите раздел 6. Повторите шаг 7.1, на этот раз добавив 100 йл TMRE только средства массовой информации к блюду. Если изображения эндогенно помечены структурами, добавьте 100 мл решения полного Шнайдера только для мультимедиа. Повторите шаги 7.2 и 7.3 для получения данных для контрольной группы.ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации митохондрий и частиц блаженства Clu, не более трех-пяти минут должно проходить от добавления перекиси водорода к изображению.

Representative Results

Описанные протоколы могут быть использованы для изучения воздействия перекиси водорода во время живой визуализации яичников Дрозофилы. Как показано на рисунке 3 , рисунок 4, видео 3 и видео 4, эта процедура обеспечивает эффективное средство для визуализации изменений тканейи динамики после экспериментального лечения в режиме реального времени. Важно отметить, что этот протокол специфичен для добавления H2O2 к ovarioles во время визуализации; однако он может быть адаптирован для экзогенного добавления других лекарственных средств или реагентов, представляющих интерес. Кроме того, фолликулы могут быть помечены любыми флуоресцентными красителями, представляющими интерес (например, тетраметхилродамин (TMRE), LysoTracker) до визуализации (Видео 3). Наиболее важными шагами к получению четких результатов визуализации являются 1) надлежащее вскрытие и изоляция одиночных яичников со всеми контрактильными элементами , удаленными(рисунок 1 и рисунок 2)и 2) скорость, с которой изображение перезапускается после добавления перекиси водорода. Видео 4 является иллюстрацией правильно рассеченного фолликула, который остается устойчивым на протяжении всей продолжительности изображения по сравнению с видео 1, который иллюстрирует плохо расчлененный фолликул, выходящий из поля зрения во время изображения. Видео 5 является иллюстрацией, в которой H2O2 влияет на TMRE помечены митохондрии уже продвинулись до начала изображения в результате слишком много прошедшего времени. По сравнению с видео 3, в котором изображение было перезапущено сразу после добавления перекиси водорода (время 0) и нетронутыми, рассеянные митохондрии все еще видны, митохондрии в Видео 5 уже начали заметно слипаться и терять свой мембранный потенциал при перезапуске изображения. Этот вопрос в основном связано с нарушением позиции образца во время H2O2 дополнение и может быть смягчена, следуя технике, чтобы сохранить изображения средств массовой информации и образца позиции нетронутыми (Видео 2). Следует отметить, что в контрольных экспериментах,выполняемыхбез добавления H 2 O2 в средства массовой информации, митохондрии в фолликулах остаются должным образом рассеяны, а краситель TMRE остается секвестрирован в митохондриях. Рисунок 1: Изоляция одного ovarioles из яичников Drosophila. (A ) Мультфильм с указанием пары яичников, один ovariole (стрелка) с зародышем на кончике (наконечник стрелы) и две мышечные оболочки, которые окружают яичников (коричневый, эпителиальный) и яичников (коричневый, брюшной). (B) Расчлененный яичник Дрозофилы. (C)Последующее разделение дразнили яичников на отдельные яичники (стрелка). Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Удаление нервных волокон и контрактильные элементы из одного ovarioles. (A) Одноместный ovariole с остатками нервной ткани и мышечной оболочки по-прежнему прилагается (стрелка). (B)Нежное удаление всех оставшихся тканей, прикрепленных к ovariole в A (стрелка). Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры. Рисунок 3: H2O 2 вызывает митохондриальную неправильное локализации. (A-A)Live-изображение еще раз сытый clu CA06604 (Clu::GFP мух) фолликула. Добавление H2O2 вызывает митохондрии слипаться в течение всего срока изображения. TMRE маркировки митохондрий указывает на то, что митохондрии первоначально рассредоточены во время 0 (A), и что митохондрии начинают слипаться после H2O2 дополнение(A) В более поздний момент времени, TMRE маркировки становится пятнистым из-за митохондрий теряют свой мембранный потенциал и, следовательно, их способность секвестр красителя.. . Белый и TMRE (A-A”). Шкала баров: 10 мкм в(A) для A-A”5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: H2O2 рассеивает Clu. (А-А) Live-изображение еще раз сытый cluCA06604 фолликула. Добавление H2O2 заставляет частицы рассеиваться и становиться однородными в цитоплазме в течение всего срока изображения. Белый и Clu::GFP (A-A”. Шкала бар: 40 мкм в( A) для A-A”5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Видео 1: Фолликул от cluCA06604 женщины. Как описано на рисунке 2, неспособность удалить нервные волокна контрактильные элементы из одного яичников вызовет отмеченный дрейф и движение яичников во время изображения и последующей неспособности анализировать данные изображений. Белый и Clu::GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Видео 2: Правильное добавление H2O2 в образец блюда. Перекись водорода должна быть добавлена в образец блюда с использованием соответствующего размера микропипюты. Распределение H2O2 без разрушения поверхности мультимедиа. Принимаются меры, чтобы избежать разрушения поверхности средств визуализации, чтобы свести к минимуму дрейф образца во время добавления перекиси водорода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Видео 3: H2O2 дополнение во время изображения TMRE помечены фолликулов. Фолликул от cluCA06604 женщина окрашены с TMRE. H2O2 вызывает митохондриальную неправильное локализации в фолликулах дрозофилы. Белый краситель TMRE. Изображение одного кадра на 15 с в течение 20 минут, и видео 10 кадров в секунду5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Видео 4: H2O2 добавление во время изображения фолликулов Clu::GFP. Фолликул от cluCA06604 женщины. H2O2 рассеивает частицы Clu, как описано на рисунке 4. Белый и Clu::GFP. Изображен один кадр на 15 с в течение 15 минут, а видео 10 кадров в секунду. 5Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.  Видео 5: Задержка изображения после H2O2 дополнение. Фолликул от cluCA06604 женщины. Добавление перекиси водорода к фолликулам является чувствительным к времени лечением. Перезапуск изображения был отложен в этом видео в результате смещения образца во время добавления H2O2. Митохондрии уже начали заметно слипаться и терять свой мембранный потенциал при перезапуске изображения во время 0 (по сравнению со временем 0 в видео 3). Неспособность быстро возобновить визуализацию после лечения приведет к неточным и непригодным для использования результатам, так как ранние экспериментальные эффекты будут пропущены до получения изображений. Белый и TMRE. Изображен один кадр на 15 с в течение 20 минут, а видео 10 кадров в секунду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Discussion

Этот протокол может быть полезным дополнением в качестве контроля для артефактов из-за вскрытия яичников и инкубации тканей для любого живого эксперимента изображений. Критические шаги аналогичны тем, которые найдены для других протоколов живого изображения. Научиться вскрывать целые яичники дрозофилы требует практики; однако, этот навык обычно можно узнать довольно быстро с соответствующими инструментами вскрытия. Труднее освоить удаляет мышцы, обволакивающие яичники и каждый ovariole¹³. Это должно быть сделано для того, чтобы мышечные сокращения не мешали приобретению имиджа. Если использование заточенных вольфрамовых игл для этого не окажется удачным, гермариум на кончике яичника можно схватить типсами и яичником вытащили из мышечной оболочки. Тем не менее, этот метод является проблематичным, если ранние стадии развития должны быть рассмотрены, потому что они могут быть повреждены. Еще один ключевой шаг заключается в том, чтобы не выбить ovarioles опираясь на нижней части блюда при добавлении H₂O₂. Еще одним важным аспектом является совместное все живые изображения: исследователь должен убедиться, что структура интереса флуоресцентно хорошо помечены перед лечением. Блюда, используемые здесь(Таблица материалов )обычно используются для живой визуализации; однако, любое блюдо или слайд со стеклянной крышкой на дне или даже большой стеклянной крышкой должны работать до тех пор, как капля средств массовой информации могут быть покрыты, чтобы предотвратить испарение средств массовой информации. В то время как мы используем определенный микроскоп, любой перевернутый микроскоп с целью достаточного увеличения, чтобы увидеть подклеточную структуру в вопросе и прилагаемую камеру, которая имеет достаточное разрешение и скорость захвата изображения должны работать.

Хотя наша лаборатория в первую очередь заинтересована в митохондриальной функции, этот метод может быть полезным для изучения динамики и локализации любой подклеточной структуры или органеллы, таких как ядро, цитоскелет или эндоплазмический цитикулум. Однако этот метод имеет ограничения. Для того, чтобы добавить перекись водорода, ткань должна быть в aqueous средств массовой информации. Альтернативным методом живой визуализации является использование галоуглеродного масла, которое сыграло важную роль в описании многих важных процессов в овариолах Drosophila, включая первый пример динамического движения GFP в^{модельном организме 7,14}. Кроме того, добавление перекиси водорода в средства массовой информации вызывает широко распространенное окислительное повреждение, которое может быть слишком общим оскорблением для ткани, чтобы быть информативным для клеточного процесса, представляющий интерес, особенно для более длительных экспериментов, исследующих развитие. Хотя это не может быть возможным для выполнения экспериментов, которые требуют визуализации клетки в течение длительных периодов времени из-за этого быстрого, обширного и, вероятно, необратимого окислительного повреждения, мы видели, что острый перекись водорода лечение мы описали применимо к большинству этапов уогенеза, как мы можем видеть те же эффекты на большинстве этапов в течение периода времени изображения. Учитывая низкую стоимость и простоту протокола, это может быть полезным контролем за ущербом и может быть использован в качестве лечения до фиксации и маркировки антител, а также.

В наших руках, H₂O_{2 лечение} имитирует изменения в митохондриальной неправильной локализации и Clu блаженство рассеивание частиц, которые мы видим в различных мутантов Drosophila. Он также имитирует результаты, которые мы видим для новых исследователей в лабораторных методов вскрытия обучения. Таким образом, этот метод ясно показал, что подготовка образца и общий клеточный стресс может привести к неожиданным и ранее необъяснимым изменениям в митохондриальной неправильной локализации и наличии частиц блаженства. Двигая этот метод вперед, концентрации перекиси водорода могут быть модулированные с использованием более высокой или более низкой концентрации. Если клеточный эффект рассматривается с использованием более низкой концентрации, вполне возможно, стресс фенотип может быть обратимым путем замены средств массовой информации с полным Шнайдера. Различные клеточные стрессоры, такие как карбонил цианид м-хлорофенил гидразон (CCCP), арсенит или простой тепловой шок может оказаться полезным для общего клеточного стресса для других субклеточных структур. Поскольку живая визуализация тканей ex vivo требует ручных манипуляций и инкубации в различных средствах массовой информации, этот контроль должен быть полезным дополнением для обеспечения того, чтобы любые наблюдения были максимально близки к нормальной физиологии.

Materials

Active dry yeast	Red Star®
CO2 gas			99.9% purity
CO2 pad
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model	Nikon
Dissecting needles – PrecisionGlide needles	BD	305165	B-D 21G1 size
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes	BD	309657	Luer-Lok tip, 3 mL size
Dissecting needles – tungsten wire	Electron Microscopy Sciences	73800
Dumont #5 forceps (2 pairs)	Fine Science Tools	11251-10
NI-150 High Intensity Illuminator	Nikon Instruments Inc.
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Fisher Scientific	10082-147
Gibco Schneider's Drosophila Media	Sigma-Aldrich	21720-024
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O	Sigma-Aldrich	H1009
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I6634
Spinning disk microscope	Nikon		Equivalent scopes may also be used
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures	Fisher Scientific	17-602E
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm	Fisher Scientific	NC9344527
Micropipettes and tips of appropiate size	Eppendorf
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL	VWR	87003-294
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	AnaSpec	AS-88061
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	5905	Wild-type flies
y w; clu[CA06604]		Available upon request.	Clu::GFP trap flies