Desenvolvemos um protocolo generalizado para dissociar uma grande quantidade de células únicas de alta qualidade a partir do epitélio e mesenquime/tecido conjuntivo de línguas de camundongos embrionários e adultos.
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Artigo de método
Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A dissociação celular tem sido um procedimento essencial para estudos no nível de células individuais e/ou a nível de população celular (por exemplo, sequenciamento de RNA de células únicas e cultura celular primária). Produzir células viáveis e saudáveis em grandes quantidades é crítico, e as condições ideais para fazê-lo são dependentes de tecidos. As populações celulares no epitélio da língua e no tecido mesenquime/conjuntivo subjacente são heterogêneas e as estruturas teciduais variam em diferentes regiões e em diferentes estágios de desenvolvimento. Testamos protocolos para isolar células do epitélio da língua do rato e do tecido mesenquime/conjuntivo nas fases de desenvolvimento inicial [dia embrionário 12.5 (E12.5)] e jovens adultos (8 semanas). Uma separação limpa entre o epitélio e o tecido mesenquime/conjuntivo subjacente foi fácil de realizar. No entanto, para processar e isolar ainda mais as células, produzir células saudáveis viáveis em grandes quantidades, e seleção cuidadosa de tampão de digestão enzimática, tempo de incubação e velocidade e tempo de centrifugação são críticos. Incubação de epitélio separado ou tecido conjuntivo/mesenquime subjacente em 0,25% Trippsin-EDTA por 30 min a 37 °C, seguido por centrifugação a 200 x g por 8 min resultou em um alto rendimento de células a uma alta taxa de viabilidade (>90%) independentemente dos estágios do rato e regiões da língua. Além disso, descobrimos que tanto células epiteliais dissociadas quanto mesenquimais/conjuntivas de línguas embrionárias e adultas poderiam sobreviver no meio baseado na cultura celular por pelo menos 3 h sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Os protocolos serão úteis para estudos que requerem a preparação de células isoladas de línguas de camundongos em estágios de desenvolvimento precoce (E12,5) e jovens adultos (8 semanas) que requerem dissociação celular de diferentes compartimentos teciduais.
Introdução
A língua dos mamíferos é um órgão complexo crítico para o sabor, fala e processamento de alimentos. É composta por vários tipos de tecidos altamente organizados compartimentados por mesenchyme/tecido conjuntivo e cobertos por uma folha epitelial estratificada contendo papilas gustativas e papilas gustativas. Populações celulares em epitélio de língua e tecido mesenquime/conjuntivo são heterogêneas. Para entender melhor as funções e distribuição de um determinado tipo de células na língua, são necessários estudos com células dissociadas. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de célula única é um método poderoso e de alto rendimento para o perfil transcriômico em células....
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Protocolo
O uso de animais (C57BL/6 camundongos ao longo do estudo) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia e esteve de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para cuidados e uso de animais para pesquisa.
1. Uso de animais
NOTA: Os camundongos foram criados e mantidos na instalação animal do departamento de Ciência Animal e Leite na Universidade da Geórgia a 22 °C sob ciclos de dia/noite de 12h.
- Designe meio-dia do dia da detecção de plugue vaginal em camundongos como embrionário (E) dia 0,5. Use embriões em E12,5 e camundongos pós-natais c....
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Resultados
Separação do epitélio da língua do tecido mesenquime/conjuntivo subjacente
Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível após a digestão adequada da enzima. Folhas epiteliais de algumas línguas são separadas sem força mecânica durante a incubação.
Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas (Figura 1B2), o que sugere que a enzi.......
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Discussão
Até o momento, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e do tecido conjuntivo/mesenquime subjacente. Este protocolo de dissociação celular atual fornece um procedimento reprodutível para gerar uma única suspensão celular com uma alta viabilidade celular (>90%) de tecidos de língua de camundongos, incluindo folhas epiteliais e tecidos mesenquime/conjuntivos em estágios embrionários e pós-natais, embora células isoladas de E12,5 e camundongos adultos sejam diferentes.......
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Divulgações
Nenhum conflito de interesses declarado.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, número de subvenção R01DC012308 e R21DC018089 para HXL. Agradecemos a Brett Marshall (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) e Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) por assistência técnica e consulta sobre a dissociação celular; para Francisca Gibson Burnley (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) para edição em inglês.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| albumina de soro bovino (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 camundongo (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| colagenase (Collagenase A) | 10103586001 | Sigma-Aldrich | |
| (35 mm de diâmetro) | Placa de cultura Genesee Scientific | 32-103G | |
| (100 mm de diâmetro) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | de 04942078001 | Sigma-Aldrich | |
| (Tesoura Fina de Estudante) | Encontre a Ferramenta Científica | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| soro bovino fetal (FBS) | fina de C838U82 | Hyclone | |
| (Dumount #3 Forceps) | Encontre a Ferramenta Científica | 11293-00 | |
| hemocitômetro | Hausser Scientific | 3520 | |
| microscópio invertido com sistema de imagem (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Pontas | de baixa retenção AMEX1000 | |
| Technologies Mini-tesoura 17014342 | |||
| (Tesoura de Mola Evo) | Ferramenta de Ciência Fina | 15800-01 | |
| urdidura de plástico | VWR | 46610-056 | |
| espátula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| pinça cirúrgica (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode' s solução | Sigma-Aldrich | T2145-10L | feita de sais de Tyrode |
| 0,25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0,1 M Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Hoefer | 33946 | feita de 1 M PBS |
| 0,22-μ filtro de seringa m | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% etanol | Koptec | 233919 | feito de 100% etanol |
| Seringa de 1 mL | BD | 8194938 | |
| tubo de microcentrífuga de baixa ligação de 5 mL | Eppendorf | 30122348 | |
| agulha 30-G | BD | 9193532 | |
| 35-μ filtro de células m | Falcon | 64750 | |
| 70-μ filtro de célula m | Falcon | 64752 |
Referências
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
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Reimpressões e permissões
