Cell dissociation från tungan Epitel och Mesenchyme/Bindväv av embryonal dag 12,5 och 8 veckor gamla möss
Summary
Vi har utvecklat ett generaliserat protokoll för att skilja en stor mängd högkvalitativa enstaka celler från epitel och mesenchyme /bindväv av embryonala och vuxna mus tungor.
Abstract
Celldisociation har varit ett viktigt förfarande för studier på individcellsnivå och/eller på cellpopulationsnivå (t.ex. RNA-sekvensering med en cell och primär cellkultur). Att ge livskraftiga, friska celler i stora mängder är avgörande, och de optimala förutsättningarna för att göra det är vävnadsberoende. Cellpopulationer i tungan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv är heterogena och vävnad strukturer varierar i olika regioner och i olika utvecklingsstadier. Vi har testat protokoll för isolera celler från mus tungan epitel och mesenchyme/bindväv i de tidiga utvecklingsmässiga [embryonala dag 12,5 (E12,5)] och unga vuxna (8 veckor) stadier. En ren separation mellan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv var lätt att åstadkomma. Men att ytterligare bearbeta och isolera celler, ge livskraftiga friska celler i stora mängder och noggrant urval av enzymatisk matsmältningsbuffert, inkubationstid och centrifugationshastighet och tid är avgörande. Inkubation av separerat epitel eller underliggande mesenkym/bindväv i 0,25% Trypsin-EDTA i 30 min vid 37 °C, följt av centrifugering vid 200 x g i 8 min resulterade i ett högt utbyte av celler med hög livskraft (>90%) oavsett musstadier och tungregioner. Dessutom fann vi att både dissocierade epitelial och mesenchymal/bindväv celler från embryonala och vuxna tungor kunde överleva i cell kultur-baserade medium för minst 3 h utan en betydande minskning av cell livskraft. Protokollen kommer att vara användbara för studier som kräver beredning av isolerade celler från mustunga vid tidig utveckling (E12.5) och unga vuxna (8-veckors) stadier som kräver celldisociation från olika vävnadsfack.
Introduction
Däggdjurstungan är ett komplext organ som är kritiskt för smak, tal och livsmedelsbearbetning. Den består av flera typer av högorganiserade vävnader som är indelade i mesenchyme/bindväv och täcks av ett stratifierat epitelpapper som innehåller smakpavalj och smaklökar. Cellpopulationer i både tungan epitel och mesenchyme/bindväv är heterogena. För att bättre förstå funktionerna och fördelningen av en viss typ av celler i tungan är studier med olika celler nödvändiga. Till exempel är RNA-sekvensering med en cell en kraftfull och hög genomströmningsmetod för transkriptionsprofilering i enskilda celler, som är utformad för att förstå transkriptionsbilden av komplex vävnad med en encellig upplösning1,2,3,4. Primär cellkultur har visat sig vara ett användbart verktyg för att studera funktionen och differentiering av stam/ stamceller för smaklökar5,6. Dessa studier kräver en stor mängd isolerade cellpopulationer av hög kvalitet (t.ex. tillräckligt totalt cellantal med rätt koncentration och hög livskraft).
Således finns det ett behov av att isolera celler från olika regioner i de språkliga vävnaderna och i olika utvecklingsstadier. För närvarande finns det inte ett detaljerat protokoll tillgängligt för cell dissociation från tungan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv. Här rapporterar vi en optimerad celldisociationsmetod för att förbereda celler för experiment som kräver hög kvalitet på levande celler som för RNA-sekvensering med en cell och primära stamcellskulturer. Vi fann att val av enzymatisk matsmältningsbuffert, mild pipetting, val av återsuspension medium och optimal centrifugationstid och hastighet är avgörande för att generera dessa stora mängder högkvalitativa celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hittills har det inte funnits ett detaljerat protokoll tillgängliga för cell dissociation från tungan epitel och underliggande mesenchyme/bindväv. Detta nuvarande cell dissociation protokoll ger en reproducerbar procedur för att generera en enda cell suspension med hög cell livskraft (>90%) från mustunga vävnader, inklusive epitelial ark och mesenchyme/bindväv i både embryonala och postnatala stadier även om isolerade celler från E12.5 och vuxna möss är olika i storlek. Till exempel är isolerade celler fr?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Institutes of Health, bidragsnummer R01DC012308 och R21DC018089 till HXL. Vi tackar Brett Marshall (University of Georgia, Aten, GA) och Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) för teknisk hjälp och samråd om celldisociation; till Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Aten, GA) för engelsk redigering.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
Referências
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
