神经元发育过程中的 ROS 活细胞成像

Summary

该协议描述了在培养斑马鱼神经元和幼虫中使用基因编码的过氧化氢（H₂O_2）生物传感器，以评估H₂O₂ 在神经系统发育过程中的生理信号作用。它可以应用于不同的细胞类型，并修改与实验治疗研究活性氧物种（ROS）在一般发展。

Abstract

活性氧物种（ROS）是成熟的信号分子，在正常发育、平衡和生理学中非常重要。在不同的ROS中，过氧化氢（H₂O_2）在细胞信号中的作用最为突出。H₂O₂在若干物种的开发过程中被牵连。例如，在受精后的头几天，斑马鱼胚胎中检测到H₂O₂的瞬时增加。此外，消耗一个重要的细胞H₂O₂源，NADPH氧化酶（NOX），损害神经系统的发展，如分化，轴向生长，和视网膜结节细胞（RGCs）在体内和体外指导。在这里，我们描述了一种在发育过程中使用基因编码的H 2 O_2-特异性生物传感器roGFP2-Orp1在培养斑马鱼神经元和整个幼虫中成像细胞内H ₂O₂水平的方法。这个探针可以在斑马鱼幼虫中短暂或稳定地表达。此外，由于基因表达或体积效应的差异，比例读数降低了检测伪证的可能性。首先，我们演示如何分离和培养从斑马鱼胚胎中衍生的RGC，这些胚胎暂时表达roGFP2-Orp1。然后，我们使用整个幼虫来监测H₂O₂水平在组织水平。传感器已通过添加 H₂O₂进行验证。此外，该方法还可用于通过产生具有组织特异性生物传感器表达的转基因动物来测量特定细胞类型和组织的 H₂O₂水平。由于斑马鱼促进遗传和发育操作，这里展示的方法可以作为测试H₂O₂在脊椎动物神经元和一般胚胎发育过程中的作用的管道。

Introduction

活性氧物种（ROS）信号调节神经系统的发展和功能^1。一个重要的细胞ROS来源是NADPH氧化酶（NOX），这是产生超氧化物和过氧化氢（H 2 O_2）2的跨膜蛋白。NOX酶存在于整个中枢神经系统（CNS）中，NOX衍生的ROS有助于神经元发育^{3、4、5、6。}神经干细胞的维持和分化，建立神经元极性，中性生长，突触可塑性已被证明需要足够的ROS 7，8，9，10，11水平。另一方面，NOXs不受控制地生产ROS会导致神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏症、多发性硬化症和创伤性脑损伤^{12、13、14。}因此，生产生理相关的ROS对于维持健康状况至关重要。

基因编码生物传感器的开发极大地促进了细胞ROS的检测。基因编码生物传感器的一个重要优点是 ROS 信号的时间和空间分辨率增加，因为这些传感器可以专门针对不同的位置。对氧化物敏感的GFP（roGFP）是一种类型的ROS生物传感器。roGFP2-Orp1变种通过其Orp1域专门检测H₂O_2，这是一种来自酵母^15，16的谷胱甘肽过氧化物类家庭蛋白。Orp1蛋白的氧化被转移到roGFP2，以改变其构象（图1A）。探测器在405纳米和480纳米附近显示两个兴奋峰，在515纳米处显示一个单个发射峰值。氧化后，兴奋峰周围的荧光强度会发生变化：当405 nm兴奋增加时，480纳米激发会减少。因此，roGFP2-Orp1 是一种比值生物传感器，H₂O_2-水平通过两个不同波长的荧光增量（图 1B）的兴奋度比率检测到。总的来说，roGFP2-Orp1 是 ROS 成像的多功能工具，可在体内高效使用。

图1：roGFP2-Orp1. （A） 氧化剂转移的示意图表示和激发光谱发生在 Orp1 和 roGFP2 之间，以响应 H₂O_2，导致 roGFP2 的构象变化。（B） roGFP2-Orp1的激发光谱显示两个兴奋峰值在405 nm和480 nm和单个排放峰值在515 nm。H₂O₂氧化后，405 nm 激发增加，而 480 nm 激发减少。这会导致 H 2_{O 2}存在的比例读出。该数字已从比兰和贝卢索夫（2017）16和摩根等人（2011）25修改。请单击此处查看此图的较大版本。

达尼奥雷里奥（斑马鱼）模型系统在应用基因编码生物传感器方面有几个优势。胚胎和幼虫的光学透明度使体内成像具有非侵入性。新的成像工具正在开发中，以实现更高的分辨率和更深的渗透^17。此外，还有既定的基因操纵工具（异位mRNA表达，托尔2转基因等）和基因组编辑（塔伦斯，CRISPR/Cas9等），促进转基因动物的生成^18。随着斑马鱼胚胎在母体之外发育，该系统进一步允许更容易地获取和操作胚胎。例如，单细胞阶段注射和药物治疗很容易做到。

在这里，我们使用斑马鱼通过注射体外转录的mRNA来暂时表达H₂O₂特异性生物传感器roGFP2-Orp1。这些胚胎可用于培养神经元的 体外 成像和 体内 成像（图2）。我们描述了从斑马鱼胚胎解剖和电镀视网膜结节细胞（RGCs）的协议，然后评估培养神经元的H₂O₂水平。然后，我们提出了一种利用共聚焦显微镜对罗格FP2-Orp1表达胚胎和幼虫进行 体内 成像的方法。这种方法不仅能够确定生理H₂O₂水平，而且还可以确定在不同的发育阶段或条件下发生的潜在变化。总的来说，该系统为检测活细胞和动物中的H₂O₂ 提供了可靠的方法，以研究H₂O₂ 在发育、健康和疾病中的作用。

图2。实验方法大纲。简言之，胚胎采集后，roGFP2-Orp1 mRNA被注射到单细胞阶段斑马鱼胚胎的蛋黄中。发育中的胚胎可用于体外和体内成像的（A）和B。（A） GFP阳性胚胎用于解剖视网膜，用于在34马力下采集RGC。分离的 RGC 镀在 ZFCM （+） 介质中的 PDL/层膜盖上。生长锥成像可以进行RGC延长他们的轴突后，6-24小时的电镀。细胞可以接受不同的治疗，以测量H₂O₂水平的潜在变化。在这里，我们测量了_RGC（红色）生长锥中的H 2 O₂水平。（B） GFP阳性胚胎用于体内成像。在理想年龄，胚胎可以麻醉并安装在35毫米玻璃底盘上，用于共焦成像。在这里，胚胎被安装在腹膜成像的通风装置上。示意图显示斑马鱼的视网膜发育。RGC 形成结膜细胞层 （GCL），这是网状网膜的最内层。RGC轴突发展成视神经，穿过中线，形成视基亚西姆。然后，RGC轴突生长，在中脑的光学构造中形成突触。请单击此处查看此图的较大版本。

Protocol

所有动物实验均经过普渡动物护理和使用委员会 （PACUC） 的合乎道德的审查和批准，遵循 NIH 指南，协议2006002050 2020 年 7 月 24 日获得批准。 1. 准备解决方案 E2 介质 （1x） 通过将 表1 中显示的所有组件组合在一起，准备 100x E2A （500 mL）、500x E2B （100 mL） 和 500x E2C （100 mL） 解决方案。高压灭菌网、E2B 和 E2C 解决方案。存储在4°C。 对于 1x E2…

Representative Results

养殖斑马鱼RGCs在1d内扩展轴突。图4A显示了H 2 O2-生物传感器的具有代表性的405/480比例图像。细胞体、轴龙和生长锥体在单个神经元中清晰可见。随着时间的推移，这些神经元可以接受不同的治疗，以监测H2O2的变化。我们以前发现，在培养介质中添加 100 μM H2O2可增加比率值，表明可以通过此系统（图 4 ）24</str…

Discussion

有几个关键步骤需要在整个协议中引起注意。我们相信，考虑到这些点将改善实验流。对于初级 RGC 培养，ZFCM（-） 的不育性非常重要，因为这种培养介质不含抗生素，在成像之前或成像期间可能发生污染。为了避免这种情况，我们建议仅在生物安全柜内准备和使用 ZFCM（-），并定期制作新鲜的 ZFCM（-） 介质（步骤 1.5）。此外，层压素库存应保持在-80°C。 解冻的层蛋白应随时储存在 4 °C。不要?…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C