Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Summary

Este protocolo descreve o uso de um peróxido de hidrogênio geneticamente codificado (H₂O₂)-biosensor em neurônios e larvas de zebrafish cultivados para avaliar os papéis de sinalização fisiológica de H₂O₂ durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Pode ser aplicado a diferentes tipos de células e modificado com tratamentos experimentais para estudar espécies reativas de oxigênio (ROS) no desenvolvimento geral.

Abstract

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas de sinalização bem estabelecidas, que são importantes no desenvolvimento normal, homeostase e fisiologia. Entre os diferentes ROS, o peróxido de hidrogênio (H₂O₂) é melhor caracterizado em relação aos papéis na sinalização celular. H₂O₂ foi implicado durante o desenvolvimento em várias espécies. Por exemplo, um aumento transitório em H₂O₂ foi detectado em embriões de zebrafish durante os primeiros dias após a fertilização. Além disso, o esgotamento de uma importante fonte celular H₂O_2, NADPH oxidase (NOX), prejudica o desenvolvimento do sistema nervoso, como a diferenciação, o crescimento axonal e a orientação das células de gânglios retinianos (RGCs) tanto in vivo quanto in vitro. Aqui, descrevemos um método para imagem intracelular H₂O_{2 níveis} em neurônios de zebrafish cultivados e larvas inteiras durante o desenvolvimento usando o biosensor específico H₂O₂geneticamente codificado, roGFP2-Orp1. Esta sonda pode ser transitória ou stably expressa em larvas de zebrafish. Além disso, a leitura ratiométrica diminui a probabilidade de detectar artefatos devido à expressão genética diferencial ou efeitos de volume. Primeiro, demonstramos como isolar e cultivar RGCs derivados de embriões de zebrafish que expressam transitoriamente roGFP2-Orp1. Então, usamos larvas inteiras para monitorar os níveis de H₂O₂ no nível do tecido. O sensor foi validado pela adição de H₂O₂. Além disso, essa metodologia poderia ser usada para medir os níveis de H₂O₂ em tipos e tecidos celulares específicos, gerando animais transgênicos com expressão biosensora específica do tecido. Como os zebrafish facilitam manipulações genéticas e de desenvolvimento, a abordagem aqui demonstrada poderia servir como um pipeline para testar o papel de H₂O₂ durante o desenvolvimento neuronal e geral embrionário em vertebrados.

Introduction

A sinalização reativa da espécie oxigênio (ROS) regula o desenvolvimento e o funcionamento do sistema nervoso¹. Uma importante fonte ros celular são as oxidases NADPH (NOX), que são proteínas transmembranas que geram superóxido e peróxido de hidrogênio (H₂O₂)². Enzimas NOX são encontradas em todo o sistema nervoso central (CNS), e ros derivado do NOX contribuem para o desenvolvimento neuronal^3,4,5,6. A manutenção e diferenciação das células-tronco neurais, o estabelecimento da polaridade neuronal, do crescimento do neurite e da plasticidade sináptica têm sido mostrados como necessários níveis adequados de ROS^7,8,9,10,11. Por outro lado, a produção descontrolada de ROS por NOXes contribui para distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer, esclerose múltipla e lesão cerebral traumática^12,13,14. Por isso, a produção de ROS fisiologicamente relevante é fundamental para a manutenção de condições saudáveis.

O desenvolvimento de biosensores geneticamente codificados facilitou muito a detecção de ROS celular. Uma vantagem importante dos biosensores geneticamente codificados é o aumento da resolução temporal e espacial do sinal ROS, pois esses sensores podem ser especificamente direcionados a locais distintos. O GFP sensível ao redox (roGFP) é um tipo desses biosensores ROS. A variante roGFP2-Orp1 detecta especificamente H₂O₂ através de seu domínio Orp1, que é uma proteína geneatoxitina de glutationa peroxiredoxina a partir da levedura^15,16. A oxidação da proteína Orp1 é transferida para roGFP2 para alterar sua conformação (Figura 1A). A sonda exibe dois picos de excitação perto de 405 nm e 480 nm, e um único pico de emissão de 515 nm. Após a oxidação, a intensidade da fluorescência em torno dos picos de excitação muda: enquanto a excitação de 405 nm aumenta, a excitação de 480 nm diminui. Assim, roGFP2-Orp1 é um biosensor ratiométrico, e os_níveisde H₂O 2 são detectados pela razão de intensidades de fluorescência animadas em dois comprimentos de onda diferentes(Figura 1B). No geral, roGFP2-Orp1 é uma ferramenta versátil para imagens ROS que pode ser utilizada de forma eficiente in vivo.

Figura 1: Espectros de representação e excitação esquemática de roGFP2-Orp1. (A) A transferência oxidante ocorre entre Orp1 e roGFP2 em resposta a H₂O₂, levando a alterações conformais no roGFP2. (B) O espectro de excitação do roGFP2-Orp1 exibe dois picos de excitação de 405 nm e 480 nm e pico de emissão única de 515 nm. Após a oxidação por H₂O_2,a excitação de 405 nm aumenta enquanto a excitação de 480 nm diminui. Isso resulta em uma leitura ratiométrica para a presença de H₂O_2. O número foi modificado de Bilan e Belousov (2017)¹⁶ e Morgan et al. (2011)²⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem várias vantagens para aplicar biosensores geneticamente codificados. A transparência óptica dos embriões e larvas permite imagens in vivo não invasivas. Novas ferramentas de imagem estão sendo desenvolvidas para alcançar maior resolução e penetração mais profunda¹⁷. Além disso, existem ferramentas estabelecidas para manipulação genética (expressão ectópica mRNA, transgênese Tol2, etc.) e edição de genomas (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), que promove a geração de animais transgênicos¹⁸. À medida que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora da mãe, este sistema permite ainda mais acesso e manipulação dos embriões. Por exemplo, injeções de estágio de uma célula e tratamentos medicamentosos podem ser facilmente feitos.

Aqui, usamos zebrafish para expressar transitoriamente o biosensor H₂O₂-específico roGFP2-Orp1 injetando mRNA in vitro transcrito. Esses embriões podem ser usados tanto para imagens in vitro de neurônios cultivados quanto para imagens in vivo (Figura 2). Descrevemos um protocolo para dissecar e emplacar células de gânglios de retina (RGCs) de embriões de zebrafish seguidos pela avaliação dos níveis de H₂O₂em neurônios cultivados. Em seguida, apresentamos um método para imagens in vivo de embriões e larvas que expressam roGFP2-Orp1 usando microscopia confocal. Esta abordagem não só permite determinar os níveis fisiológicos H₂O_2,mas também possíveis mudanças ocorridas em diferentes estágios ou condições de desenvolvimento. No geral, este sistema fornece um método confiável para detectar H₂O₂ em células vivas e animais para estudar o papel de H₂O₂ no desenvolvimento, saúde e doenças.

Figura 2. Esboço da abordagem experimental. Brevemente, após a coleta de embriões, roGFP2-Orp1 mRNA é injetado na gema de embriões de zebrafish estágio de uma célula. Embriões em desenvolvimento podem ser usados paraimagens in vitro ede vivo . ( A )Osembriões GFP positivos são usados para dissecar retinas para coleta de RGC a 34 hpf. Os RGCs dissociados são emplacados em tampas revestidas de PDL/laminina na mídia ZFCM (+). A imagem do cone de crescimento pode ser conduzida à medida que os RGCs estendem seus axônios após 6-24 h de revestimento. As células podem ser submetidas a diferentes tratamentos para medir as possíveis mudanças nos níveis de H₂O_2. Aqui, medimos h₂O_{2 -níveis}nos cones de crescimento de RGCs (vermelho). (B) Os embriões positivos GFP são utilizados para imagens in vivo. Na idade desejada, os embriões podem ser anestesiados e montados em pratos de fundo de vidro de 35 mm para imagens confocal. Aqui, os embriões são montados ventrally para imagem da retina. Esquema mostra desenvolvimento de retina em zebrafish. Os RGCs formam camada de células de glion (GCL), que é a camada mais interna da retina. Os axônios RGC desenvolvem-se em nervo óptico para cruzar a linha média, formando quiasmo óptico. Em seguida, os axônios RGC crescem dorsais para fazer sinapses no tectum óptico no cérebro médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram eticamente revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais purdue (PACUC), seguindo as diretrizes do NIH com o protocolo 2006002050 aprovado em 24/07/2020. 1. Preparação de soluções Mídia E2 (1x) Prepare soluções 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando todos os componentes mostrados na Tabela 1. Soluções Autoclave E2A, E2B e E2C. Armazenar a 4 °C. Para 1x E…

Representative Results

RGCs de zebrafish cultivados estendem axônios dentro de 1d. Uma imagem representativa da razão 405/480 do biosensor H2O2é mostrada na Figura 4A. O corpo celular, o axônio e os cones de crescimento são claramente visíveis em neurônios individuais. Esses neurônios podem ser submetidos a diferentes tratamentos ao longo do tempo para monitorar as alterações de H2O2. Descobrimos anteriormente que adicionar 100 μM H2O2 à…

Discussion

Existem várias etapas críticas que precisam de atenção ao longo deste protocolo. Acreditamos que considerando esses pontos melhorará o fluxo experimental. Para a cultura primária do RGC, a esterilidade do ZFCM(-) é muito importante, uma vez que esta mídia cultural não contém antibióticos e a contaminação pode ocorrer antes ou durante a imagem. Para evitá-lo, aconselhamos preparar e usar ZFCM(-) somente dentro de um gabinete de biossegurança e fazer novas mídias ZFCM(-) regularmente (Passo 1.5). Além diss…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C