Визуализация живых клеток ROS во время развития нейронов
Summary
Этот протокол описывает использование генетически закодированного перекиси водорода (H2 O2)-биосенсорав культивируемых нейронах рыбок данио и личинках для оценки физиологических сигнальных ролей H2 O2во время развития нервной системы. Он может быть применен к различным типам клеток и модифицирован с помощью экспериментальных методов лечения для изучения активных форм кислорода (АФК) в общем развитии.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) являются хорошо зарестающимися сигнальными молекулами, которые важны для нормального развития, гомеостаза и физиологии. Среди различных АФК перекись водорода(H2O2)лучше всего характеризуется в отношении ролей в клеточной сигнализации. H2O2 был замешан во время разработки нескольких видов. Например, преходящее увеличениеH2O2 было обнаружено у эмбрионов рыбок данио в течение первых дней после оплодотворения. Кроме того, истощение важного клеточного источникаH2O2, NADPH-оксидазы (NOX), ухудшает развитие нервной системы, такое как дифференцировка, рост аксонов и руководство ганглиозными клетками сетчатки (RGCs) как in vivo, так и in vitro. Здесь мы описываем метод визуализации внутриклеточных уровнейH2O2 в культивируемых нейронах рыбок данио и целых личинках во время развития с использованием генетически закодированногоH2O2-специфическогобиосенсора roGFP2-Orp1. Этот зонд может быть временно или стабильно экспрессирован в личинкам рыбок данио. Кроме того, ратиометрическое считывание уменьшает вероятность обнаружения артефактов из-за дифференциальной экспрессии генов или эффектов объема. Во-первых, мы демонстрируем, как изолировать и культивировать RGC, полученные из эмбрионов рыбок данио, которые временно экспрессируют roGFP2-Orp1. Затем мы используем целые личинки для мониторинга уровня H2O2 на тканевом уровне. Датчик был проверен добавлением H2O2. Кроме того, эта методология может быть использована для измерения уровнейH2O2 в определенных типах клеток и тканей путем генерации трансгенных животных с тканеспецифической экспрессией биосенсора. Поскольку рыбки данио облегчают генетические манипуляции и манипуляции с развитием, продемонстрированный здесь подход может служить конвейером для проверки ролиH2O2 во время нейронного и общего эмбрионального развития у позвоночных.
Introduction
Передача сигналов активных форм кислорода (АФК) регулирует развитие и функционирование нервнойсистемы1. Важным клеточным источником АФК являются NADPH оксидазы (NOX), которые представляют собой трансмембранные белки, образующие супероксид и перекись водорода (H2O2)2. Ферменты NOX обнаруживаются по всей центральной нервной системе (ЦНС), а АФК, полученная изNOX,способствует развитию нейронов3,4,5,6. Было показано, что поддержание и дифференцировка нервных стволовых клеток, установление полярности нейронов, роста нейритов и синаптической пластичности требуют адекватных уровней АФК7,8,9,10,11. С другой стороны, неконтролируемое производство АФК ТОКС способствуют нейродегенеративным расстройствам, включая болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и черепно-мозговую травму12,13,14. Следовательно, производство физиологически значимого АФК имеет решающее значение для поддержания здоровых условий.
Разработка генетически закодированных биосенсоров значительно облегчила обнаружение клеточного АФК. Одним из важных преимуществ генетически закодированных биосенсоров является повышенное временное и пространственное разрешение сигнала АФК, поскольку эти датчики могут быть специально нацелены на различные места. Окислительно-чувствительный GFP (roGFP) является одним из типов таких биосенсоров ROS. Вариант roGFP2-Orp1 специфически обнаруживает H2O2 через свой домен Orp1, который представляет собой белок семейства глутатиона пероксиредоксинов из дрожжей15,16. Окисление белка Orp1 переносится в roGFP2 для изменения его конформации(рисунок 1A). Зонд демонстрирует два пика возбуждения около 405 нм и 480 нм и один пик излучения при 515 нм. При окислении интенсивность флуоресценции вокруг пиков возбуждения изменяется: при увеличении возбуждения 405 нм снижается возбуждение на 480 нм. Таким образом, roGFP2-Orp1 является логометрическим биосенсором, а уровниH2O2-определяются соотношением интенсивностей флуоресценции, возбуждаемых на двух разных длинах волн(рисунок 1B). В целом, roGFP2-Orp1 является универсальным инструментом для визуализации АФК, который можно эффективно использовать in vivo.
Рисунок 1:Схематическое представление и спектры возбуждения roGFP2-Orp1. (A)Перенос окислителя происходит между Orp1 и roGFP2 в ответ наH2O2,что приводит к конформационным изменениям roGFP2. (B)Спектры возбуждения roGFP2-Orp1 демонстрируют два пика возбуждения при 405 нм и 480 нм и одинарный пик излучения при 515 нм. При окислении наH2O2 возбуждение405 нм увеличивается, а возбуждение 480 нм уменьшается. Это приводит к ратиометрическому считываю для присутствия H2O2. Рисунок был изменен с Bilan and Belousov (2017)16 и Morgan et al. (2011)25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Модельная система Danio rerio (рыбки данио) имеет ряд преимуществ для применения генетически закодированных биосенсоров. Оптическая прозрачность эмбрионов и личинок позволяет проводить неинвазивную визуализацию in vivo. Разрабатываются новые инструменты визуализации для достижения более высокого разрешения и более глубокого проникновения17. Кроме того, существуют установленные инструменты для генетических манипуляций (эктопическая экспрессия мРНК, трансгенез Tol2 и др.) и редактирования генома (TALENs, CRISPR/Cas9 и др.), что способствует генерации трансгенных животных18. Поскольку эмбрионы рыбок данио развиваются вне матери, эта система дополнительно облегчает доступ и манипулирование эмбрионами. Например, инъекции на одноклеточной стадии и медикаментозное лечение могут быть легко сделаны.
Здесь мы использовали рыбок данио для временной экспрессииH2O2-специфическогобиосенсора roGFP2-Orp1 путем инъекции транскрибированной in vitro мРНК. Эти эмбрионы могут быть использованы как для визуализации культивированных нейронов in vitro, так и для визуализации in vivo (рисунок 2). Мы описываем протокол для рассечения и покрытия ганглиозных клеток сетчатки (RGC) из эмбрионов рыбок данио с последующей оценкой уровнейH2O2в культивированных нейронах. Затем мы представляем метод визуализации in vivo roGFP2-Orp1-экспрессирующих эмбрионов и личинок с использованием конфокальной микроскопии. Такой подход позволяет не только определить физиологические уровниH2O2,но и потенциальные изменения, происходящие на разных стадиях развития или в различных условиях. В целом, эта система обеспечивает надежный метод обнаруженияH2O2 в живых клетках и животных для изучения ролиH2O2 в развитии, здоровье и болезни.
Рисунок 2. Схема экспериментального подхода. Вкратце, после сбора эмбрионов, мРНК roGFP2-Orp1 вводят в желток эмбрионов одноклеточной стадии данио. Развивающиеся эмбрионы могут быть использованы как для(A) in vitro, так и(B) in vivo визуализации. (A) GFP-положительные эмбрионы используются для рассечения сетчатки для сбора RGC при 34 л.с. Диссоциированные RGC покрываются на обшивки с PDL/ламининым покрытием в средах ZFCM (+). Визуализация конуса роста может проводиться по мере того, как RGC расширяют свои аксоны после 6-24 ч покрытия. Клетки могут подвергаться различным методам лечения для измерения потенциальных изменений в уровняхH2O2. Здесь мы измерилиH2O2-уровни в ростовых конусах RGC (красный). (B)GFP-положительные эмбрионы используются для визуализации in vivo. В желаемом возрасте эмбрионы могут быть обезболиваться и устанавливаться на стеклянную посуду со стеклянным дном 35 мм для конфокальной визуализации. Здесь эмбрионы устанавливаются вентрально для визуализации сетчатки. Схема показывает развитие сетчатки у рыбок данио. RGC образуют ганглионный клеточный слой (GCL), который является самым внутренним слоем в сетчатке. Аксоны RGC развиваются в зрительный нерв, пересекая среднюю линию, образуя зрительный хиазм. Затем аксоны RGC растут дорсально, чтобы сделать синапсы в зрительном тектуме в среднем мозге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько критических шагов, которые требуют внимания в этом протоколе. Мы считаем, что рассмотрение этих моментов улучшит экспериментальный поток. Для первичной культуры RGC стерильность ZFCM(-) очень важна, поскольку эта культуральная среда не содержит антибиотиков, и загряз?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (грант R01NS117701), Национальным научным фондом (грант 1146944-IOS), Фондом исследований черепно-мозгового мозга и черепно-мозговой травмы штата Индиана (грант 20000289), Исследовательским фондом Пердью (грант 209911) и Офисом исполнительного вице-президента по исследованиям и партнерствам в Университете Пердью (грант 210362). Мы благодарим д-ра Кори Уивера и Хейли Редер за создание протокола культивирования рыбок данио RGC. Мы также благодарим Хейли Редер за предоставление данных рисунка 4. Мы благодарим Лию Биази и Кенни Нгуена за помощь в культуре RGC. Мы благодарим Джентри Ли за редактирование текста. Мы благодарим д-ра Тобиаса Дика за предоставление roGFP2-Orp1 и д-ра Цин Дэна за вектор pCS2+, содержащий roGFP2-Orp1. Рисунок 2 создан с помощью Biorender.com.
Materials
| 35-mm culture dish | Sarstedt | 83-3900 | |
| 35-mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cover glass | Corning | 2850-22 | |
| Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
| Glucose | Sigma Aldich | G7528 | |
| HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
| Injection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Inverted Microscope | Nikon | TE2000 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | 710 | |
| Leibovitz's L-15 Medium with phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
| Leibovitz's L-15 Medium without phenol red | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
| Low melting agarose | Promega | V2111 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| PBS | Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Phenol Red | Sigma Aldich | P0290 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
| QiaQUICK PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Recombinant mouse slit2 | R&D Systems | 5444-SL-050 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldich | P5280 | |
| Steritop 0.22 µm filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma Aldich | E10521 | |
| Vertical Pipette Puller | David Kopf Instruments | 700C |
Referências
- Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
- Bedard, K., Krause, K. -. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
- Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
- Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
- Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
- Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
- Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
- Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
- Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
- Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
- Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
- Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
- Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
- Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
- Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
- Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
- Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
- Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
- Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
- Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
- Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
- Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
- Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
- Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
- Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
- Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
- Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
