वीवो कैल्शियम इमेजिंग में माउस जेनिकुलेट गैंगलियन न्यूरॉन प्रतिक्रियाओं का स्वाद उत्तेजनाओं के लिए
Summary
यहां हम एक जीवित, एनेस्थेटाइज्ड प्रयोगशाला माउस के जेनिकेट गैंगलियन को कैसे बेनकाब करते हैं और उत्तेजनाओं का स्वाद लेने के लिए इन न्यूरॉन्स के कलाकारों की टुकड़ियों की प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग कैसे करें, विभिन्न उत्तेजक के साथ कई परीक्षणों के लिए अनुमति देते हैं। यह गहराई से तुलना के लिए अनुमति देता है जिसमें से न्यूरॉन्स किस टैस्टेंट का जवाब देते हैं।
Abstract
पिछले दस वर्षों के भीतर, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों (GECIs) में प्रगति ने वीवो कार्यात्मक इमेजिंग में एक क्रांति को बढ़ावा दिया है । न्यूरोनल गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में कैल्शियम का उपयोग करना, ये तकनीकें वास्तविक समय में विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं के लिए बड़े न्यूरोनल कलाकारों की टुकड़ियों के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने का एक तरीका प्रदान करती हैं। हमने, और अन्य लोगों ने इन तकनीकों को व्यक्तिगत जेनिगुलेट गैंगलियन न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को छवि देने के लिए लागू किया है ताकि जीवित एनेस्थेटाइज्ड चूहों की जीभ पर लागू उत्तेजनाओं का स्वाद लिया जा सके। जेनिलेट गैंगलियन में पूर्वकाल की जीभ और तालू के साथ-साथ कान के पिन्ना को इनरवेट करने वाले कुछ सोमेटोसेंसरी न्यूरॉन्स के कोशिका निकाय शामिल हैं। GCaMP के साथ व्यक्तिगत जेनिकेट गैंगलियन न्यूरॉन्स के स्वाद पैदा प्रतिक्रियाओं इमेजिंग जंगली प्रकार चूहों में इन न्यूरॉन्स की ट्यूनिंग प्रोफाइल के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की गई है और साथ ही एक तरह से आनुवंशिक रूप से हेरफेर चूहों में परिधीय स्वाद miswiring फेनोटाइप का पता लगाने के लिए । यहां हम जेनिकुलेट गैंगलियन, जीएमपी फ्लोरेसेंस इमेज एक्विजिशन, डेटा विश्लेषण के लिए शुरुआती कदम और समस्या निवारण का पर्दाफाश करने के लिए सर्जिकल प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं। इस तकनीक का उपयोग ट्रांसजेनिक रूप से एन्कोडेड जीसीएएमपी, या एएवी-मध्यस्थता जीसीएएमपी अभिव्यक्ति के साथ किया जा सकता है, और ब्याज के विशेष आनुवंशिक सबसेट (यानी, क्रे-मध्यस्थता जीसीएएमपी अभिव्यक्ति) में संशोधित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, जेनिलेट गैंगलियन न्यूरॉन्स की वीवो कैल्शियम इमेजिंग परिधीय गुस्ताख़ न्यूरॉन्स की गतिविधि की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है और अधिक पारंपरिक पूरे तंत्रिका कोरडा टायपानी रिकॉर्डिंग या स्वाद व्यवहार परख करने के लिए पूरक जानकारी प्रदान करता है।
Introduction
स्तनधारी परिधीय स्वाद प्रणाली का एक प्रमुख घटक जेनिलेट गैंगलियन है। कान के पिन्ना को इनरवेट करने वाले कुछ सोमाटोसेंसरी न्यूरॉन्स के अलावा, जेनिलेट में पूर्वकाल की जीभ और तालू को इनरवेट करने वाले गुस्तरी न्यूरॉन्स के सेल निकाय शामिल होते हैं। अन्य परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स के समान, जेनिलेट गैंगलियन न्यूरॉन्स छद्म-एकध्रुवीय होते हैं, जिनमें स्वाद कलियों के लिए परिधीय रूप से पेश किया जाता है, और एकान्त पथ1के ब्रेनस्टेम नाभिक के लिए केंद्रीय रूप से। इन न्यूरॉन्स को मुख्य रूप से एटीपी की रिहाई द्वारा स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं द्वारा सक्रिय किया जाता है जो मौखिक गुहा2,3में उत्तेजनाओं का स्वाद लेते हैं । एटीपी स्वाद संकेत के लिए एक आवश्यक न्यूरोट्रांसमीटर है, और गुस्तारी गैंगलियन न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त P2rx रिसेप्टर्स उनके सक्रियण4के लिए आवश्यक हैं। यह देखते हुए कि स्वाद रिसेप्टर कोशिकाएं किसी विशेष स्वाद के तौर-तरीकों (मीठा, कड़वा, नमकीन, उमामी, या खट्टे) के लिए विशिष्ट स्वाद रिसेप्टर्स व्यक्त करती हैं, यह परिकल्पना की गई है कि उत्तेजनाओं का स्वाद लेने के लिए गड़गड़ाहट वाले गैंगलियन न्यूरॉन प्रतिक्रियाएं भी संकीर्ण रूप से5ट्यून की जाएंगी।
पूरी तंत्रिका रिकॉर्डिंग में चोरडा टायपानी और अधिक से अधिक बेहतर पेट्रोसल तंत्रिकाएं दिखाई गई हैं जो जेनिकुलेट गैंगलियन6,7के लिए सभी पांच स्वाद के तौर -तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, यह अभी भी किसी दिए गए टैक्टेंट के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं की विशिष्टता के बारे में सवाल छोड़ दिया है: यदि स्वाद के तौर-तरीके विशिष्ट न्यूरॉन्स, पॉलीमोडल न्यूरॉन्स, या दोनों का मिश्रण है। एकल फाइबर रिकॉर्डिंग व्यक्तिगत फाइबर और उनकी रासायनिकसंवेदनशीलता8,9,10की गतिविधि के बारे में अधिक जानकारी देते हैं, लेकिन यह पद्धति फाइबर की छोटी संख्या से डेटा एकत्र करने तक सीमित है। इसी तरह, व्यक्तिगत चूहे के जीनुलेट गैंगलियन न्यूरॉन्स की वीवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग मेंव्यक्तिगत न्यूरॉन्स11, 12,13की प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी देते हैं, लेकिन फिर भी जनसंख्या की गतिविधि खो देता है और प्रति पशु अपेक्षाकृत कुछ न्यूरॉन रिकॉर्डिंग पैदा करता है। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की गतिविधि की दृष्टि खोने के बिना न्यूरोनल कलाकारों की टुकड़ी की प्रतिक्रिया पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए, नई तकनीकों को नियोजित करने की आवश्यकता है।
कैल्शियम इमेजिंग, विशेष रूप से जीसीएएमपी जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करते हुए, इस तकनीकीसफलता14, 15,16,17,18प्रदान की गई है। GCaMP न्यूरोनल गतिविधि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कैल्शियम का उपयोग करता है, सेल वृद्धि के भीतर कैल्शियम के स्तर के रूप में हरी फ्लोरेसेंस में वृद्धि। ध्वनि अनुपात के संकेत में सुधार करने, बाध्यकारी गतिज को समायोजित करने और विशेष प्रयोगों के लिए अनुकूलित करने के लिए GCaMP के नएरूपोंको विकसित किया जाना जारी है। GCaMP पूरे तंत्रिका रिकॉर्डिंग के विपरीत एकल न्यूरॉन रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, और एक साथ एकल फाइबर या एकल सेल रिकॉर्डिंग के विपरीत न्यूरॉन्स के कलाकारों की टुकड़ी की प्रतिक्रियाओं को माप सकता है। जेनिकुलेट गैंगलिया की कैल्शियम इमेजिंग ने पहले ही जंगली प्रकार के चूहों16,20में इन न्यूरॉन्स की ट्यूनिंग प्रोफाइल के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की है और आनुवंशिक रूप से हेरफेर चूहों में परिधीय स्वाद की पहचान की है ।
जेनिलेट गैंगलियन के लिए वीवो कैल्शियम इमेजिंग तकनीकों में लागू करने के लिए एक बड़ी कठिनाई यह है कि यह बोनी tympanic बुल्ला के भीतर समझाया जाता है। जेनिलेट तक ऑप्टिकल पहुंच प्राप्त करने के लिए, गंगलियन को बरकरार रखते हुए हड्डियों की परतों को हटाने के लिए नाजुक सर्जरी की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने अन्य शोधकर्ताओं को जेनिकेट गैंगलियन तक पहुंचने में मदद करने के लिए इस गाइड का निर्माण किया है और वीवो में उत्तेजनाओं का स्वाद लेने के लिए इन न्यूरॉन्स की GCaMP मध्यस्थता फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं की छवि बनाई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम शल्य चिकित्सा से जेनिलेट गैंगलियन को बेनकाब करने और जीएएमपी 6 के साथ अपने न्यूरॉन्स की गतिविधि को नेत्रहीन रिकॉर्ड करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया कुछ उल्लेखन?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एस हुमायूं को माउस पालन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस कार्य के लिए वित्तपोषण यूटीएसए के ब्रेन हेल्थ कंसोर्टियम ग्रेजुएट और पोस्टडॉक्टोरल सीड ग्रांट (बीईएफ) और एनआईएच-एससी2-जीएम130411 से एलजे.M के हिस्से में प्रदान किया गया है ।
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
Referências
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