स्पष्टता ऊतक समाशोधन विधि के साथ पूरे माउंट रेटिना की इम्यूनोदाता
Summary
यहां हम मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला और रेटिना न्यूरॉन्स और उनके उपकोशिकीय संरचनाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए पूरे माउंट रेटिना के लिए मस्तिष्क ऊतकों की स्पष्टता विधि को अनुकूलित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
ऊतक हाइड्रोगेल डिलिपिडेशन विधि (स्पष्टता), मूल रूप से Deisseroth प्रयोगशाला द्वारा विकसित, संशोधित किया गया है और व्यापक रूप से इम्यूनोदाता और मोटी मस्तिष्क नमूनों की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया । हालांकि, इस उन्नत तकनीक का इस्तेमाल अभी तक होल माउंट रेटिना के लिए नहीं किया गया है। हालांकि रेटिना आंशिक रूप से पारदर्शी है, लगभग 200 माइक्रोन (चूहों में) की इसकी मोटाई अभी भी गहरे ऊतक में एंटीबॉडी के प्रवेश को सीमित करती है और साथ ही उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए प्रकाश प्रवेश को कम करती है। यहां, हमने एक नैनोपोरस हाइड्रोजेल बनाने के लिए एक्रिलैमाइड मोनोमर के साथ उन्हें बहुलीकृत करके पूरे माउंट माउस रेटिना के लिए स्पष्टता विधि को अनुकूलित किया और फिर प्रोटीन हानि को कम करने और ऊतक क्षति से बचने के लिए उन्हें सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट में साफ़ किया। स्पष्टता-संसाधित रेटिना रेटिना न्यूरॉन्स, ग्लियल कोशिकाओं और सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांड थे, जो अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में घुड़सवार थे, और इमेज्ड थे। हमारे डेटा प्रदर्शित करता है कि स्पष्टता मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला और पूरे माउंट तैयारी में रेटिना न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के लिए इमेजिंग की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, डोपामिनर्जिक आमाक्रीन कोशिकाओं की ठीक एक्सॉन जैसी और डेंड्रिटिक संरचनाओं के 3 डी संकल्प में स्पष्टता द्वारा बहुत सुधार हुआ। गैर-प्रसंस्कृत पूरे माउंट रेटिना की तुलना में, स्पष्टता सिनैप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 जैसे सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेटिंग प्रकट कर सकती है। हमारे परिणाम बताते हैं कि स्पष्टता लिपिड को हटाने के बाद रेटिना को अधिक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी बनाता है और रेटिना न्यूरॉन्स और उनके प्रोटीन की ठीक संरचनाओं को बरकरार रखता है, जिसका उपयोग नियमित रूप से रेटिना न्यूरॉन्स और पूरे माउंट तैयारी में उनके उपकोशिकीय संरचनाओं के उच्च-संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कशेरुकी रेटिना शायद केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का सबसे सुलभ हिस्सा है, और यह मस्तिष्क के विकास, संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है। रेटिना में न्यूरॉन्स के पांच वर्गों को दो प्लेक्सिफॉर्म परतों से अलग तीन परमाणु परतों में वितरित किया जाता है। बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) में शास्त्रीय फोटोरिसेप्टर (छड़ और शंकु) होते हैं जो प्रकाश को विद्युत संकेतों में परिवर्तित करते हैं। विद्युत संकेतों को आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) में न्यूरॉन्स द्वारा संसाधित किया जाता है, जिसमें द्विध्रुवी, क्षैतिज और अमैक्रिन कोशिकाएं शामिल हैं, और फिर गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) में रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) को प्रेषित किया जाता है। आरजीसी रेटिना के आउटपुट न्यूरॉन्स हैं, जिनमें एक्सॉन मस्तिष्क को छवि बनाने और गैर-छवि बनाने वाले दृश्य समारोह में योगदान करने के लिए पेश करते हैं। इसके अलावा, तीन प्रकार की ग्लियल कोशिकाएं (मूलर कोशिकाएं, एस्ट्रोग्लिया और माइक्रोग्लिया) न्यूरॉन्स को पोषक तत्व प्रदान करती हैं और न्यूरॉन्स को उनके बाह्राश वातावरण में हानिकारक परिवर्तनों से बचाती हैं।
आमाक्रीन कोशिकाओं की एक विशेष उप-आबादी सीएनएस में एक महत्वपूर्ण न्यूरोमोदुलेटर डोपामाइन का उत्पादन और विज्ञप्ति करती है, जो प्रकाश अनुकूलन1, 2केदौरानरेटिना तंत्रिका सर्किट को फिर से कॉन्फ़िगर करती है। डोपामिनेर्गिक अमैक्रिन कोशिकाओं (डीएसीएस) में रूपात्मक प्रोफाइल की एक अनूठी विशेषता है। उनकी सोमता प्रोसर्मल आईएनएल में स्थित हैं, जिसमें इनर प्लेक्सिफॉर्म लेयर (आईपीएल) के सबसे डिस्टल हिस्से में डेंड्रिट्स रैमिफाइंग हैं । डीएसीएस की एक्सॉन जैसी प्रक्रियाएं अअस्प्राषित, पतली और लंबी, विरल रूप से शाखाबद्ध और भालू वैरिकोसिटी (डोपामाइन रिलीज की साइटें) हैं। वे आईपीएल में डेंड्राइट्स के साथ एक घने जाल बनाते हैं, जिसमें एआईआई अमैक्रिन कोशिकाओं की सोमता के आसपास रिंग जैसी संरचनाएं शामिल हैं । अक्षतंप भी ओपीएल की ओर आईएनएल के माध्यम से चलाते हैं, रेटिना3भर में एक अपकेंद्रित्र मार्ग बनाने । हमने दिखा दिया है कि डैक प्रक्रियाएं प्रेसिनैप्टिक न्यूरॉन्स से ग्लूटामेट रिलीज के जवाब में रिसेप्टर्स व्यक्त करती हैं, जिसमें द्विध्रुवी कोशिकाएं और आंतरिक रूप से फोटोसेंसिटिव रेटिना गैंगलियन कोशिकाएं (आईपीआरजीसी)4,5,6शामिल हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ग्लूटामेट रिसेप्टर्स एक्सॉन, डेंड्राइट्स, या दोनों पर व्यक्त करते हैं क्योंकि वे ऊर्ध्वाधर रेटिना वर्गों में कटे हुए हैं और एक दूसरे से प्रतिष्ठित नहीं किए जा सकतेहैं 5,6। DACs की त्रि-आयामी शाखाओं को प्रकट करने और उपकोशिकीय डिब्बों पर ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की उपस्थिति को प्रकट करने के लिए पूरे माउंट रेटिना में इम्यूनोस्टेपिंग किए जाने की आवश्यकता है। हालांकि रेटिना अपेक्षाकृत पारदर्शी है, एक माउस पूरे माउंट रेटिना की मोटाई लगभग 200 माइक्रोन है, जो गहरे ऊतक में एंटीबॉडी के प्रवेश को सीमित करता है और साथ ही ऊतक प्रकाश-बिखरने के कारण उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए प्रकाश प्रवेश को कम करता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए विकसित इम्यूनोस्टेटिंग संगत ऊतक हाइड्रोजेल डिपिडेशन विधि (स्पष्टता) को पूरे माउंट माउस रेटिना7के लिए अनुकूलित किया।
स्पष्टता विधि मूल रूप से रोगदाग और घने मस्तिष्क के नमूनों की इमेजिंग के लिए Deisseroth प्रयोगशाला द्वारा विकसित किया गया था7. यह लिपिड घटकों (जो ऊतक प्रकाश-बिखरने का कारण बनता है) को हटाने के लिए एक मजबूत डिटर्जेंट, सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एसडीएस) और इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करता है, जिससे प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जगह में जाते हैं। हटाए गए लिपिड को शेष प्रोटीन संरचना का समर्थन करने के लिए एक्रिलैमाइड जैसे हाइड्रोगेल मोनोमर से बने पारदर्शी पाड़ के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। साफ ऊतक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से लेबल किया जा सकता है और ऊतक के माध्यम से काफी वृद्धि हुई प्रकाश प्रवेश गहराई के साथ छवि (ऊतक सतह के नीचे कई मिलीमीटर तक) । तब से, स्पष्टता विधि को कई अनुसंधान समूहों8,9,10द्वारा अनुकूलित और सरलबनायागया है। एक संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल पूरे मस्तिष्क और अन्य अक्षुण्ण अंगों को साफ करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा उत्पादित संभावित ऊतक क्षति से बचने के लिए एक निष्क्रिय समाशोधन तकनीक का उपयोग करता है11। हालांकि, इस विधि को अभी तक पूरे माउंट रेटिना पर लागू नहीं किया गया है। यहां, हमने पूरे माउंट रेटिना के लिए निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक को अनुकूलित किया ताकि उन्हें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग के लिए अधिक पारदर्शी बनाया जा सके। हमने पाया कि इस प्रक्रिया के दौरान इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए परीक्षण किए गए अधिकांश रेटिना प्रोटीन संरक्षित थे । अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान का उपयोग करके, हम पूरे माउंट रेटिना में ओएनएल से जीसीएल तक लगभग 200 माइक्रोन मोटाई में रेटिना न्यूरॉन्स को छवि देने में सक्षम थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूरे माउंट रेटिना के लिए स्पष्टता प्रोटोकॉल का संशोधन।
हमने वैक्यूम निकासी या इंडिकेशन चैंबर की आवश्यकता के बिना पर्याप्त बहुलीकरण प्राप्त करने के लिए स्पष्टता प्रोटोकॉल को सरल बनाया है, जैस…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए बिंग सुनो, नाथन स्पिक्स और हाओ लियू का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट EY022640 (D.-Q.Z.) और ओकलैंड यूनिवर्सिटी प्रोवोस्ट अंडरग्रेजुएट स्टूडेंट रिसर्च अवार्ड (ईजेए) ने सपोर्ट किया ।
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
Referências
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