استخدام أداة E1A Minigene لدراسة تغييرات الربط مرنا
Summary
يقدم هذا البروتوكول أداة سريعة ومفيدة لتقييم دور البروتين مع وظيفة غير مطهرة في تنظيم الربط البديل بعد العلاج الكيميائي.
Abstract
تتضمن معالجة الحمض النووي الريبي خطوات متعددة في وقت واحد لإعداد مرنا للترجمة، مثل 5’capping، إضافة متعددة A والربط. وإلى جانب الربط التأسيسي، يسمح الربط البديل من الحمض النووي الريبي بالتعبير عن البروتينات متعددة الوظائف من جين واحد. كما دراسات interactome عموما التحليل الأول للبروتينات الجديدة أو غير معروفة، وارتباط بروتين الطعم مع عوامل الربط هو مؤشر على أنه يمكن أن تشارك في عملية الربط ميرنا، ولكن لتحديد في أي سياق أو ما هي الجينات التي تنظم هي عملية تجريبية. نقطة انطلاق جيدة لتقييم هذه الوظيفة هو استخدام أداة مينيجين الكلاسيكية. هنا نقدم استخدام مينيجين E1A أدينوفيرالي لتقييم التغييرات الربط البديلة بعد محفزات الإجهاد الخلوية المختلفة. قمنا بتقييم الربط من E1A minigene في HEK293 الإفراط في التعبير عن بروتين Nek4 بعد علاجات الإجهاد المختلفة. ويشمل البروتوكول E1A minigene transfection، والعلاج الخلوي، واستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA، تليها PCR وتحليل هلام وتكميم المتغيرات E1A مقسمة. استخدام هذه الطريقة البسيطة والراسخة جنبا إلى جنب مع علاجات محددة هو نقطة انطلاق موثوقة لتسليط الضوء على العمليات الخلوية أو ما هي الجينات التي يمكن تنظيمها عن طريق الربط ميرنا.
Introduction
الربط هو من بين أهم الخطوات في معالجة الحمض النووي الريبي eukaryotic الذي يحدث في وقت واحد إلى 5’mRNA توج و3’mRNA polyadenylation، تتألف من إزالة intron تليها تقاطع exon. الاعتراف مواقع الربط (SS) من قبل الربط، وهو مجمع ريبونوكليوبروتين تحتوي على البروتينات الريبونوكليوبروتين الصغيرة (snRNP U1، U2، U4 و U6)، والحمض النووي الريبي الصغيرة (snRNAs) والعديد من البروتينات التنظيمية1 ضروري للربط.
إلى جانب إزالة intron (الربط التأسيسي) ، في eukaryotes ، يمكن الاحتفاظ introns ويمكن استبعاد exons ، وتكوين عملية تسمى mRNA الربط البديل (AS). توسيع الربط البديل قبل مرنا القدرة على الترميز من الجينوم eukaryotic السماح لإنتاج عدد كبير ومتنوع من البروتينات من عدد قليل نسبيا من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن 95-100٪ من mRNAs الإنسان التي تحتوي على أكثر من exon واحد يمكن أن تخضع للصق بديل2،3. وهذا أمر أساسي للعمليات البيولوجية مثل تطوير الخلايا العصبية، وتنشيط موت الخلايا المبرمج واستجابة الإجهاد الخلوي4،وتوفير بدائل الكائن الحي لتنظيم عمل الخلية باستخدام نفس ذخيرة الجينات.
الآلات اللازمة للربط البديل هي نفسها المستخدمة في الربط التأسيسي واستخدام SS هو المحدد الرئيسي لحدوث الربط البديل. الربط التأسيسي يرتبط باستخدام مواقع الربط القوية ، والتي عادة ما تكون أكثر تشابها مع الزخارف التوافقية للاعتراف باللصق5.
وعادة ما يتم التعرف على exons البديلة أقل كفاءة من exons التأسيسية مرة واحدة في رابطة الدول المستقلة– العناصر التنظيمية ، وتسلسل في 5 SS و 3 SS يحيط هذه exons ، وتظهر قدرة ملزمة أدنى إلى الربط. يحتوي مرنا أيضا على مناطق تسمى القدرة أو كواتم الصوت الموجودة في exons (معززات الربط exonic (ESEs) وكاتم الصوت اللصق exonic (ESSs)) و introns (القدرة على الربط intronic (ISEs) وكاتم الصوت الربط intronic (ISSs)) التي تعزز أو قمع استخدام exon، على التوالي5. يتم التعرف على هذه التسلسلات من خلال العناصر العابرة للتنظيم، أو عوامل الربط (SF). يتم تمثيل SFs بشكل رئيسي من قبل عائلتين من البروتينات ، وعوامل الربط الغنية بالسرين / الأرجينين (SRSFs) التي ترتبط ب ESEs وعائلة البروتينات الريبونوكليوبروتية النووية غير المتجانسة (hnRNPs) التي ترتبط بتسلسل ESSs5.
يمكن تعديل الربط البديل عن طريق الفوسفور / إزالة الفوسفور من العوامل العابرة لتعديل شركاء التفاعلات والتوطين الخلوي لعوامل الربط6و7و8. ويمكن أن يوفر تحديد منظمين جدد لعوامل الربط أدوات جديدة لتنظيم الربط، وبالتالي بعض علاجات السرطان.
أنوفرييفا وآخرون.9, في صورة التعبير الجيني ميكروراي مرنا, لاحظت تغييرات متسقة في مستويات المكونات اللصق في 101 خطوط الخلية وبعد ظروف الإجهاد المختلفة (الأدوية القائمة على البلاتين, تشعيع غاما, مثبطات توبويسوميراز, مثبطات كيناز التيروزين والتكسير). العلاقة بين نمط الربط وفعالية العلاج الكيميائي وقد ثبت بالفعل في خلايا سرطان الرئة, التي هي مقاومة للعلاج الكيميائي, تظهر تغييرات في المتغيرات caspase-9 معدل10. تظهر خلايا HEK293 المعالجة بلوحة العلاج الكيميائي تغييرات في الربط مع زيادة في المتغيرات المؤيدة للبوبتوتيك. ولاحظ غابرييل وآخرون11 تغيرات في ما لا يقل عن 700 حدث من أحداث الربط بعد علاج سيسبلاتين في خطوط الخلايا المختلفة، مشيرا إلى أن مسارات الربط تتأثر سيسبلاتين. وقد أظهرت التشكيلات الربط بالفعل النشاط المضاد للورم، مما يدل على أن الربط مهم للتنمية الورمية، وأساسا، استجابة العلاج الكيميائي12. وبالتالي ، فإن توصيف البروتينات الجديدة التي تنظم الربط بعد عوامل الإجهاد الخلوية ، مثل العلاج الكيميائي ، مهم جدا لاكتشاف استراتيجيات جديدة للعلاج.
يمكن أن تتطلب أدلة تنظيم الربط البديل من دراسات interactome ، ذات الأهمية الخاصة لتوصيف وظائف البروتينات الجديدة أو غير المكصرة ، نهجا أكثر عمومية وبساطة للتحقق من الدور الحقيقي للبروتين في AS. Minigenes هي أدوات هامة لتحليل الدور العام للبروتين التي تؤثر على تنظيم الربط. أنها تحتوي على أجزاء من جين الفائدة التي تحتوي على مناطق الجينوم مقسمة بدلا من ذلك ويحيط13. استخدام أداة minigene يسمح تحليل الربط في الجسم الحي مع العديد من المزايا مثل طول minigene الذي هو طفيف، وبالتالي ليس قيدا على رد فعل تضخيم; يمكن تقييم نفس المينيجين في خطوط الخلايا المختلفة؛ جميع المكونات الخلوية، وأساسا تعديل ما بعد الترجمة تنظيم (الفوسفور والتغيرات في مقصورات الخلية) موجودة ويمكن معالجتها13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة التغيرات في نمط الربط البديل بعد الإجهاد الخلوي، واستخدام نظام مينيجين، تسمح لتحديد المسار الذي يتم تحويره من قبل محفزات مختلفة.
هناك العديد من أنظمة minigene الموصوفة بالفعل والتي هي محددة لأنواع مختلفة من الأحداث الربط13،14، ومع ذلك ، كخبار أولي ، فإن minigene E1A15 هو نظام مراسل الربط البديل الراسخ للغاية لدراسة اختيار 5 SS في الجسم الحي. من جين واحد فقط، E1A، يتم إنتاج خمسة mRNAs بواسطة الربط البديل على أساس اختيار ثلاثة مواقع مختلفة 5′ لصق واحد رئيسي أو واحد طفيفة 3′ لصق الموقع16،17،18. التعبير عن المتغيرات E1A يتغير وفقا لفترة العدوى الغدية19،20.
لقد أظهرنا سابقا أن كلا من isoforms Nek4 تتفاعل مع عوامل الربط مثل SRSF1 وhnRNPA1 وعلى الرغم من isoform 2 التغييرات minigene E1A الربط البديل، isoform 1 ليس له أي تأثير في ذلك21. لأن isoform 1 هو isoform الأكثر وفرة ويغير مقاومة العلاج الكيميائي والاستجابة للتلف الحمض النووي، ونحن تقييم ما إذا كان يمكن تغيير الربط البديل E1A minigene في حالة الإجهاد.
الفحص مينيجين هو بسيط، منخفضة التكلفة وطريقة سريعة، لأنه يحتاج فقط استخراج الحمض النووي الريبي، توليف cDNA، تضخيم وجل agarose التحليلات، ويمكن أن يكون أداة مفيدة لتقييم منذ تأثير محتمل على الربط البديل من قبل بروتين المصالح حتى تأثير العلاجات المختلفة على نمط الربط البديل الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigenes هي أدوات هامة لتحديد الآثار في الربط البديل العالمي في الجسم الحي. وقد استخدمت adenoviral minigene E1A بنجاح لعقود لتقييم دور البروتينات عن طريقزيادة كميةهذه في الخلية 13,14. هنا، نقترح استخدام E1A minigene لتقييم الربط البديل بعد التعرض للعلاج الكيميائي. تم استخدام خط …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فونداساو دي أمبارو بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP، من خلال غرانت تيماتيكو 2017/03489-1 إلى JK وزمالة إلى FLB 2018/05350-3) وConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) لتمويل هذا البحث. نود أن نشكر الدكتور أدريان كراينر على توفير البلازميد pMTE1A وZerler وزملاؤه لعملهم في الاستنساخ E1A. كما نشكر البروفيسورة باتريسيا موريل، والأستاذة الدكتورة واندا بيريرا ألميدا، والبروفيسور الدكتور مارسيلو لانسيلوتي، والبروفيسورة الدكتورة كارينا كوغو كوغو مولر للسماح لنا باستخدام مساحة ومعدات مختبرهم.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Referências
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
